Molekul á ris farming kutat á sa, fejleszt é se é s alkalmaz á sa n ö v é nyekn é l

1. Molekuláris farming kutatása, fejlesztése és alkalmazása növényeknél Dr. Miskei Márton DE, AMTC, MTK, Kertészettudományi és Növényi Biotechnológiai Tsz.

2. DNS Az RNS virusok kivételével az élőlények örökítő anyaga a DNS (dezoxiribonukleinsav)

3. A növények genomi DNS-e a sejtmagban található kromoszómákba kondenzálódva

4. A növények extranukleáris DNS-e a mitokondriumokban és a plasztiszokban található gyűrűs formában

5. A transzkripció és a transzláció folyamata

6. Géntechnológia: Növényi sejtek, sejtorganellumok genetikai változtatása molekuláris biológiai módszerekkel GM (géntechnológiával módosított, transzgénikus) növények: Olyan növények, melyek genetikai állományába a géntechnológia molekuláris genetikai módszereivel idegen gént (transzgént) juttatnak be, amely beépűl, működik és öröklődik.

7. A géntechnológia történeti áttekintése 1979 Az első kísérletek a növényi géntechnológiában 1980-as évek Transzformációs rendszerek kidolgozása 1983-84 Az első transzgénikus növények Fraley és mtsai. Horsch és mtsai. De Block és mtsai.

8. A géntechnológia történeti áttekintése 1986 Az első vírus- (Powel és mtsai., Baulcombe és mtsai.), rovar- (Vaeck és mtsai.), herbicidrezisztens (Shah és mtsai.) GM növények 1986-tól GM növény szántóföldi kísérlete (USA) 1988-tól GM növény szántóföldi kísérlete (Európa) 1994 GM növény forgalomba kerülése

9. A géntechnológia történeti áttekintése • Első generációs transzgénikus növények • A mezőgazdasági termelés segítése (vírus-, gomba-, baktérium-, rovar-, herbicid reszisztencia) • Második generációs transzgénikus növények • A növények anyagcseréjének és fejlődésének módosítása (fehérje-, zsírsav-, szénhidrát anyagcsere, érés, hímsterilitás) • Harmadik generációs transzgénikus növények • Különféle speciális anyagok előállítása (élelmiszeripar, műanyagipar, gyógyszeripar)

10. Transzgén bejuttatása génpuskával Transzgén bejuttatásaAgrobacterium tumefaciens fertőzéssel Transzgén bejuttatása protoplasztokba „Molecular pharming” Gyógyszeralapanyagok előállítása genetikailag módosított növényekkel (emberi fehérjék, antitestek, vakcinák) Transzformáció: A transzgén bejuttatása a növénybe

11. A fertőzött növényeken tumorképződés I. Transzgén bejuttatása Agrobacterium tumefaciens fertőzéssel Az agrobaktériumok a kétszikü növényeket fertőzik a sebzési helyeken

12. Vektorok • Extrakromoszómális DNS, baktériumokra és egysejtű gombákra jellemző • A jobb túlélőképességhez szükséges géneket tartalmazzák pl.: rezisztencia gének • Képes önállóan osztódni, így átkerül az utódsejtbe • Génsebészeti módszerekkel egyszerűen manipulálható

13. Agrobaktérium-fertőzés

14. Ti plazmid felépítése

15. Nicotiana tabacum (dohány) • Gyorsan nő, kevés törődést igenyel • Genomja ismert • Régóta használják a növénygenetikában • Szöveteiből könnyen regenerálható új növény

16. Szelekciós táptalajra helyezzük a korongokat Transzformáció Fertőzés agrobaktérium szuszpenzióval

17. A protoplaszt-szuszpenzióhoz adjuk a DNS-t II. Transzgén bejuttatása protoplasztokba A növényi sejtek sejtfalát leemésztjük Elektroporáció PEG (Polietilén-glikol) kezelés Regeneráltatás és szelekció

18. III. Transzgén bejuttatása génpuskával Néhány um átmérőjű wolfram vagy arany részecskére adszorbeált plazmid molekula Génpuska nagy sebességgel lövi be a szövetekbe a plazmidot A sejtfalon keresztüljutó részecskék egy része eltalálja a sejtmagot Integrálódik a bevitt DNS a genomba

19. Transzformálás Antibiotikumot tartalmú regenerációs táptalaj

20. Szelekciós táptalajra helyezzük a korongokat

21. Legújabb transzformációs rendszerek Kloroplaszt transzformáció Mitokondrium transzformáció A gének expressziójának szabályzása Külső szignal kapcsolja az expressziót Az expresszió csak bizonyos szövetféleségekben indul el Mesterséges kromoszóma

22. Penicillium chrysogenum antifungális fehérje (PAF) termeltetése transzgénikus dohány (Nicotiana tabacum) növényben

23. Bevezetés • növény transzformálás • harmadik generációs transzgénikus növények • fehérje termeltetés növényekkel (nagy mennyiség, alacsony költség) • célkitűzés: • transzformációs technikák elsajátítása • modellszervezet: dohány • modellfehérje: PAF

24. PAF Pre Pro Mature PAF 276 bp 96 aa Összeszerelődés Lokalizáció Modell rendszerek • Dohány (Nicotiana tabacum) • transzfromációs rendszerek • gyorsan növő, könnyen regenerálható • PAF - Penicillium chrysogenum antifungális fehérje • kis moltömegű, bázikus, ciszetinben gazdag • rendellenes hifák, gátolt szaporodás

25. Transzfromálási technikák • nukleáris transzformálás • Agrobacterium tumefaciens Ti plazmid • T-DNS szakaszba transzgén • kloroplaszt transzformálás • homológ rekombináció • magas expressziós színt • nincs pollentranszmisszió LTR LTR Szelekciós marker Szelekciós marker Vad típusú plasztisz DNS LTR Transzformált plasztisz DNS transzgén RTR transzgén RTR RTR

26. Nukleáris transzformálás I. • klónozó vektor szerkezete • jobb (LB), bal (LB) határ szekvenciák • kanamycin szelekciós marker • PAF kazetta LB S35 Kanamycin szelekciós marker Tnos P2 RB PAF kazetta Tnos

27. Tnos P2’ PAF PAF Pre Pre Pro Pro Mature PAF MaturePAF Tnos Tnos P2’ P2’ GE 38P PAF PAF PAF Pre Pre Pro Pro Mature PAF Mature PAF MaturePAF Mature PAF Tnos Tnos P2’ Nukleáris transzformálás II. Pre-Pro-mature-PAF Pre-Pro-mature-PAF+ozmotin ozmotin Tnos P2’ GE+Pre-Pro-mature-PAF 38P+Pre-Pro-mature-PAF mature-PAF PAF 38P+mature-PAF P2’ 38P

28. 1 kb –os standard paf pozitív kontroll negatív kontroll LB S35 Kanamycin szelekciós marker Tnos P2 RB PAF kazetta Tnos Nukleáris transzformálás I. • klónozó vektor szerkezete • jobb (LB), bal (LB) határ szekvenciák • kanamycin szelekciós marker • PAF kazetta • Agrobacterium tumefaciens transzformálása • növények fertőzése • regenerálás kanamycin tartalmú szelekciós táptalajokon • regenerált növények vizsgálata DNS, RNS szinten

29. Kloroplaszt transzformálás I. • klónozó vektor szerkezete • jobb (LTR), bal (RTR) oldali target régiók • aadA szelekciós kazetta - spectinomycin, streptomycin • promóter (Prrn), terminátor (TrnC) szekvencia, transzgén • transzformálás génpuskával LTR Pro Mature PAF trnC Prrn aadA szelekcióskazetta RTR

30. transzformánsok szelektálása spectinomycin tartalmú regenerációs táptalaj spectinomycin streptomycin spectinomycin Kloroplaszt transzformálás II.

31. 1 kb-os standard 1. paf LTR Pro Mature PAF trnC Prrn aadA szelekcióskazetta RTR 2. negatív kontroll pozitív kontrollok Kloroplaszt transzformálás I. • klónozóvektor szerkezete • jobb (LTR), bal (RTR) oldali target régiók • aadA szelekciós kazetta - spectinomycin, streptomycin • promóter (Prrn), terminátor (TrnC) szekvencia • transzformálás génpuskával • regenerálás antibiotikum tartalmú táptalajokon • transzgén beépülésének vizsgálata DNS szinten

32. Összefoglalás • több vektorkonstrukció tervezése • nukleáris transzformálás • kloroplaszt transzformálás • transzformánsok bizonyítása DNS, RNS szinten • tervek: • kloroplaszt transzformánsoknál a homoplazmikusság vizsgálata Sothern blot technikával • termelődött PAF fehérje kimutatása Western blot technikával • PAF fehérje tulajdonságainak megjelenése a növényben gombafertőzés hatására • más gazdaságilag fontos, illetve nem fehérje természetű anyag termeltetése növényekkel • további növényen kidolgozni a transzfromációs technikákat

33. A GM növények fogadtatása Mérlegelni kell! Zöld szervezetek (pl.: Greenpeace) Multinacionális cégek http://www.greenpeace.org/india/news/gm-indian-food-greenpeace-flags-the-good-the-bad

34. A GM élelmiszerek egészségkárosítása Csak féligazságokat hallunk! Veszélyes megenni? „Nincs bizonyíték, hogy nem károsak.” „...egy génkezelt krumplifajta kóros elváltozásokat okoz az ezzel táplált patkányokon...”

35. A GM élelmiszerek egészségkárosítása Csak féligazságokat hallunk! Veszélyes megenni? „2008-ban 25 országban ... 13,3 millió gazda foglalkozott genetikailag módosított növények termesztésével.” „Az 2008-ig 13 éves, 700 millió hektáros elterjedés mellett nem fordult elő olyan egészségügyi vagy környezeti probléma, amelynek jelentkezése tudományosan bizonyíthatóan összefüggésben lett volna a genetikailag módosított növények termesztésével.”

36. A GM élelmiszerek egészségkárosítása Tények! Allegizálhat a transzgénről expresszálódott fehérje A transzgén károsan befolyásolhatja a növény fiziológiai folyamatait Antibiotikum rezisztenciát alakíthat ki A transzgén önmaga veszélytelen, ha az általa kódolt fehérje nem jelenik meg az élelmiszerben A hatékony védelem rovarírtó- és gyomirtó szerek nélkül Nagyobb terméshozam, egészségesebb, védettebb növény

37. A GM élelmiszerek egészségkárosítása Konklúzió • Ne utasítsuk el tudatlanság vagy félelem miatt! • A hagyományos növénytermesztés, védelem gyakran károsabb • Lehetnek GM élelmiszerek, de több kritérium betartásával: • A cégtulajdonosok vállaljanak felelősséget a termékeikért • Tudjuk meg mit és hogyan módosítottak (legalább szakmai körökben) • Amit megeszünk ne akkumuláljon gyomirtót, nehézfémet... • Legyen vizsgálva az allergizáló hatása, és okoz-e toxicitást • Legyen tényleg olcsó, hogy segítsen az éhínség problémáján

38. A GM növények ökológiai hatása Jelentősebb az ökológiai kockázat „A természeti környezetbe való kijutásával a génmódosított élőlény beporzással, vagy a magok kihullása révén ellenőrizhetetlenül kereszteződhet más, rokon fajtákkal, így “elszennyezve” azok genetikai állományát.” „A ma termesztett génmódosított növények 99%-a gyomirtószerekkel, illetve kártevőkkel szembeni ellenálló-képességet hordoz, amely tulajdonságok a fogyasztó számára semmilyen kézzelfogható előnnyel nem járnak.”

39. A GM növények ökológiai hatása Jelentősebb az ökológiai kockázat „Az 2008-ig 13 éves, 700 millió hektáros elterjedés mellett nem fordult elő olyan egészségügyi vagy környezeti probléma, amelynek jelentkezése tudományosan bizonyíthatóan összefüggésben lett volna a genetikailag módosított növények termesztésével. ” „A spanyol és az ahhoz hasonló eredményt nyújtó francia és német kísérletek alapján legfeljebb 20 m izolációs távolság szükséges a genetikailag módosított és hagyományos kukorica tábla között, a 0,9 százalék feletti keveredés elkerüléséhez. A 0,9 % alatti véletlenszerű keveredés a biotermékek esetében is megengedett az Európai Uniós szabályozás alapján.”

40. A GM növények ökológiai hatása Tények Létezik a pollentranszmisszió Olcsóbb az élelmiszerek előállítása Felfigyeltek a kutatók is a kockázati tényezőkre Gyakran GM növények végzik a környezeti károk felszámolását (nehézfém mentesítés)

41. A GM növények ökológiai hatása Konklúzió Új módszerek fejlesztése feloldhatja az ökológiai kockázatot (kloroplaszt trasnszformáns, szabályozott expresszió) Ne termesszék egymás közelében a transzgént tartalmazó növényt és az azzal rokon vad típusú növényt Ha biztonságos és olcsó egyben, akkor alkalmas a nagymennyiségű élelmiszer előállításra Alternatíva a zárt rendszerű nagyüzemi termelés (bioreaktor, nagyüzemi üvegház)

42. A GM növények gyógyszer- és ipari alapanyag előállításra Zárt rendszerben, megfelelő ipari technológiával hatékonyan termelhető és kivonható a kívánt alapanyag Alkalmas ipari alapanyag előállítására, kiváltva költségesebb, környezetet károsító technológiákat Nagymennyiségű, biztonságos vakkcinák előállítására, hormonok és más drága enzimek előállítására használható Előállíthatóak olyan fehérjék, melyek révén nem fehérje természetű alapanyagok létrehozhatók

43. A GM növények szigorú szabályozása EU komolyan veszi a kockázatokat, ezért biztonságos, de gyakran nehézkes a GM növények termesztése, előállítása EU színten szúrópróbaszerűen ellenőrizhetőek az egyes laboratóriumok, cégek Magyarországom a FVM foglalkozik a laboratóriumok akkreditálásában Komoly engedélyeztetési eljárás Szigorú hulladékmegsemmisítés és szállítás

44. Elfogadjuk a GM növényeket? ? http://www.eurekastreet.com.au/article.aspx?aeid=8150 http://www.wired.com/techbiz/people/magazine/15-07/st_kia Nehéz kérdés, de vajon kell dönteni? Gondolkozzunk józanul!

45. Köszönöm a figyelmet