Analisi degli alimenti (LMC-5: NITROSAMMINE) Giorgio Bonaga

1. Analisi degli alimenti (LMC-5: NITROSAMMINE) Giorgio Bonaga Anno Accademico 2010/2011 Laurea Magistrale inCHIMICA

2. ANALISIDELLE NITROSAMMINE

3. NITROSAMMINE I nitroso-composti (NOC) comunemente chiamati nitrosoammine sono un gruppo di sostanze di diversa struttura chimica che contengono un gruppo funzionale -N-N=O. Si formano per reazione di un agente nitrosante (HNO2, NO2NOCl, ecc.) con ammine secondarie, terziarie e più raramente quaternarie. L’attenzione verso queste sostanze è dovuta a tre ragioni: molte nitrosammine sono potenti cancerogeni verso molte specie animali; molte nitrosammine sono risultate mutageniche; livelli relativamente elevati di alcune nitrosammine si possono formare negli alimenti e bevande (birra, formaggi, ecc.), specialmente quelli conservati con nitriti e nitrati (carni). La World HealthOrganization(WHO) raccomanda per gli alimenti freschi e affumicati una concentrazione di N-nitrosammine compresa tra 0,002 e 0,004 mg/kg (2 - 4 ppb).

4. La sintesi delle nitrosammine, come conseguenza dell’assunzione di nitriti e nitrati presenti negli alimenti, avviene nello stomaco dove si realizzano le condizioni ambientali (pH ≈ 3, elevata concentrazione degli ioni cloro del succo gastrico) per la sintesi del cloruro di nitrosile (Cl-N=O), il vero agente nitrosante della ammine secondarie e terziarie. + + H + + H + H - I. O N O O N O O N O H H pH ≈ 3 cloruro di nitrosile - + Cl II. + H O X N O 2 R R + + N H N X N O H X N O R R N,N-dialchilammina N-nitroso-N,N-dialchilammina

5. I nitriti e nitrati sono additivi comuni delle carni conservate (bovine, suine, ecc.) perché svolgono 3 funzioni importanti: impediscono lo sviluppo del Clostridiumbotulinum, un batterio la cui tossina è molto pericolosa (botulismo); reagiscono con la mioglobina (il pigmento della carne) per formare nitroso-mioglobina, di colore rosso vivo; sono sinergici con il NaCl, il sale impiegato nella salagione e nella stagionatura delle carni. Anche se i nitrati sono più stabili e meno tossici dei nitriti, in realtà si convertono parzialmente in nitriti per azione della nitratoriduttasi. Per stabilire la congruità con le disposizioni di legge sul contenuto di nitrati (250 mg/kg carne) e di nitriti (150 mg/kg carne), una prima analisi è quella del dosaggio dei due sali. La determinazione dei nitriti e dei nitrati negli alimenti viene fatta, tradizionalmente, con metodi spettrofotometrici il cui limite è la scarsa sensibilità nella rivelazione di tracce di analiti e le frequenti interferenze della matrice. Attualmente si preferisce la HPLC che è più accurata, rapida e sensibile, anche se frequentemente questa tecnica richiede procedure laboriose per la precipitazione delle proteine e/o una purificazione del campione attraverso una SPE.

6. ANALISI DEI NITRITI E DEI NITRATI I nitriti e i nitrati vengono estratti da campioni (di carne) e analizzati direttamente. 10 g (salame o prosciutto) + 100 ml H2O omogenizzazione estrazione (70-80°C, 15 min) ESTRATTO centrifugazione filtrazione FILTRATO HPLC

7. nitrito nitrato A B nitrito nitrato Fig. 1 – HPLC (anion-exchange chromatography) di nitriti e nitrati nel prosciutto (A) e nel salame (B). PRECOLONNA: IonPac AS11 COLONNA: IonPac AG11 FASE MOBILE: soluzione 5 mM NaOH DETECTOR: UVD a 225 nm

8. ANALISI DELLE NITROSAMMINE Le diverse tecniche analitiche utilizzate più tradizionalmente per il dosaggio delle nitrosammine volatili negli alimenti sono poco sensibili, come la TLC, o richiedono una strumentazione complessa e costosa (GC-MS e CL). Per questi motivi negli ultimi anni la HPLC, specialmente la tecnica RPC, è il metodo più utilizzato, nonostante la necessità di derivatizzare gli analiti per migliorare la sensibilità del rivelatore FLD.

9. 100 g (alimento) + 100 ml H2O omogeneizzazione + 10 g NaCl + 10 g Na2SO4 + 5 ml soluzione al 2% H2N-C6H4-SO3H + 10 ml soluzione 1N H2SO4 distillazione in corrente di vapore CONDENSATO estrazione con CH2Cl2 (5 x 10 ml) filtrazione FILTRATO evaporazione derivatizzazione (dansyl chloride) HPLC

10. 1 = N-nitroso-N,N-dimetilammina (NDMA) 2 = N-nitroso-N,N-dietilammina (NDEA) 3 = N-nitroso-N,N-dipropilammina (NDPA) Fig. 1 – HPLC di N-nitrosammine (dansyl-derivati) di estratto di salame. COLONNA: 80 mm x 2 mm, Zorbax ODS 5,0 mm FASE MOBILE: ACN:H2O = 2:1 VELOCITA’ FLUSSO: 150 ml/min DETECTOR: FLD (lex 350 nm, lem 530 nm)

11. 1 = N-nitroso-N,N-dimetilammina (NDMA) 2 = N-nitroso-N,N-dietilammina (NDEA) 3 = N-nitroso-pirrolidina (NPYR) 4 = N-nitroso-piperazina (NPIP) 5 = N-nitroso-N,N-dibutilammina (NDBA) TOTALE = (1,0+1,2+0,8+1,3+1,1) = 5,4 ppb Fig. 1 – TIC della GC-MS di nitrosammine estratte (SPE) da aringhe affumicate (hot). COLONNA: 30 m x 0,25 mm, HP-1701 f.t. 0,25 mm TEMPERATURA: 35 (1’) 240 (1’), 50°C/min CARRIER GAS (He): 1,0 ml/min DETECTOR: MS (CI - NH3)