STUDIO ESPRESSIONE GENICA

1. STUDIO ESPRESSIONE GENICA

2. I meccanismi di controllo usati per regolare l’espressione dei geni umani devono essere molto più complessi da quelli utilizzati dagli altri organismi. • Regolazione trascrizionale • Regolazione post-trascrizionale • Meccanismi epigenetici e controllo • dell’espressione genica a lunga distanza

3. Cellula umana contiene circa 30000 geni RNA genes Geni per proteine Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola parte di questo potenziale (˜ 5000 geni) Geni housekeeping Geni tessuto - specifici metabolismo biosintesi membrana istoni ribosomali DIFFERENZIAMENTO CELLULARE A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE (IN GENERE) UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA

4. Esistono molteplici livelli di regolazione dell’espressione genica negli eucarioti NUCLEO DNA Meccanismi epigenetici:controllo a lungo raggio mediante rimodellamento della struttura della cromatina controllo trascrizionale: legame di fattori trascrizionali tessuto specifici, legame diretto di ormoni, fattori di crescita o elementi intermedi a elementi risponsivi di geni inducibili Trascritto primario (precursore) controllo post-trascrizionale: splicing alternativo, polyA alternativo, RNA editing tessuto-specifico mRNA controllo del trasporto CITOPLASMA mRNA controllo traduzionale controllo della stabilità traduzione degradazione PROTEINA controllo post-traduzionale PROTEINAattiva o inattiva

5. Meccanismi epigenetici • Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che non sono direttamente attribuibili alla sequenza del DNA. • Metilazione del DNA; • Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della C. Solo il 3% delle C sono metilate ed in genere è bersaglio della metilazione la C della doppietta CpG. • Modificazioni degli istoni; • Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni, responsabili di cambiamenti conformazionali della cromatina.

6. Meccanismi epigenetici: Metilazione del DNA La metilazione del DNA è un processo post-replicativo. L’estensione delle modificazioni riguardanti la metilazione del DNA è fondamentalmente decisa durante lo sviluppo. La metilazione del DNA è quindi uno dei meccanismi correlati con il differenziamento cellulare, tramite l’inibizione dell’espressione genica a livello trascrizionale.

7. Quali regioni sono bersaglio della metilazione? • I geni dei vertebrati attivamente trascritti sono “marcati” da “isole CpG” al 5’. In queste regioni la frequenza di CpG è uguale a quella attesa nel DNA totale (40% GC), nella restante parte del genoma è invece più bassa del 20% rispetto all’atteso • Nel genoma umano il 56% dei geni sono associati a isole CpG: tutti i geni housekeeping ed il 40% dei geni con espressione tessuto-specifica • I geni tessuto-specifici sono metilati in CpG nei tessuti dove non sono espressi

8. Repressori e attivatori possono dirigere la deacetilazione/acetilazione degli istoni a livello di specifici geni Importanza della struttura modulare e delle interazioni proteina-proteina

9. Meccanismi epigenetici: Modificazioni degli Istoni I residui amminoacidici all’N-terminale di ciascun istone (20-60 residui) si estendono al di fuori della superficie del nucleosoma.Queste regioni sono particolarmente ricche in lisina (K) che può essere reversibilmente modificata mediante acetilazione, fosforilazione e metilazione.

10. Modificazioni degli istoni H3 e H4 La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che metilata. L’acetilazione è associata alla cromatina trascrizionalmente attiva, ma se la regione cromatinica viene metilata a livello del DNA (CpG), le proteine che si legano al DNA metilato richiamano le deacetilasi istoniche, che rimuovono i gruppi acetile e le metil transferasi istoniche, legate alle CpG binding protein, metilano gli istoni. Il risultato è la condensazione della cromatina.

11. CARATTERISTICHE DELLA CROMATINA Trascrizione inattiva Trascrizione attiva

12. Controllo Trascrizionale Il metodo principale col quale avviene il controllo dell’espressione genica negli eucarioti è una trascrizione selettiva, che si ottiene grazie a specifiche “DNA binding proteins”.

13. TBP TFIIs Pol.II Basal tr. machinery TATA ~ -50 ~ -200 PROSSIMALE CORE ENHANCER (~ 1-10 kb) PROMOTORE LA CROMATINA Diversamente dai procarioti, la trascrizione dei geni eucarioti e’ controllata da numerosi elementi Perche’?

14. Una serie di fattori trascrizionali deve legarsi al promotore prima che possa farlo la RNA polimerasi. Quindi se la RNA polimerasi potrà iniziare la trascrizione dipenderà anche dal legame di proteine regolatorie, attivatori e repressori. Promotore basale Elementi prossimali Elementi distali

15. Il promotore del gene umano dell’insulina Nero: fattori ubiquitari Rossi: fattori specifici delle cellule beta pancreatiche

16. Il complesso trascrizionale dell’RNA polimerasi II viene assemblato a tappe successive (in vitro) TBP + TAFs=TFIID Lodish

18. Esempio di come i diversi elementi di controllo di un gene possono integrarsi a livello del promoter “core”

19. Classi di fattori trascrizionali • Zinc finger ( motivo a “dita di zinco”) • Leucine zipper (serratura a leucina) • homodomain (omodomini) assomigliano strutturalmente a regolatori batterici di tipo helix-turn-helix • Helix-loop-helix (elica-ansa-elica). Le proteine appartenenti a questa classe, anche nota come HLH possono formare omo o etero-dimeri • Recettori steroidei

26. Metodi per studiare i fattori trascrizionali • EMSA • DNA footprinting • Trasfezioni transienti • Geni reporter

27. Gel Mobility Shift Assay (Electrophoresis Mobility Shift Assay, EMSA)

28. DNA Footprinting

30. Saggio per la Beta-galattosidasi

31. CAT

32. LUCIFERINA OXY-LUCIFERINA O- COOH OH -O S N S N Luciferasi S S N N Mg2+ + ATP + O2 + AMP +PPi + CO2 + LUCE Luciferasi