Cos’è la terapia genica

1. Cos’è la terapia genica • Per terapia genica si intende l'introduzione di un gene che ha come effetto quello di prevenire o correggere una condizione patologica. • Tipi di terapia genica • Somatica: • Manipolare l’espressione genica in cellule del paziente, permettendo di trasferire tale mutazione alla progenie • Germinale: • modificare geneticamente le cellule germinali per trasferire il cambiamento alla progenie

2. Strategieterapeutiche • Compensare una mutazione che causa laperdita di una funzione cellulare • (sostituzione del gene perso o difettivo) ad esempio in patologie autosomiche recessive o autosomiche dominanti caratterizzate da aploinsufficienza) • Sostituire/inattivare unamutazione negativa dominante • (sostituire il gene dominante nel suo locus o degradare selettivamente il suo RNA)

3. Strategie terapeutiche • Uccisione diretta di cellule patologiche (in genere tumorali) • Uccisione di cellule patologiche mediata dal sistema immunitario (tumori)

4. Il vettore • Per trasferire il transgene nella cellula bersaglio è necessario disporre di un sistema in grado di veicolarvi all’interno il DNA, cioè un VETTORE. • Un vettore efficiente deve: • Essere selettivo • Entrare facilmente nelle cellule-target • Essere esprimibile in elevate quantità • Essere sicuro • Esistono due grandi categorie di vettori che consentono il trasferimento genico: • Vettori non virali: si basano sull’uso di DNA, da solo o complessato a molecole che ne facilitino l’ingresso nella cellula. • Vettori virali: si basano sull’utilizzo di virus opportunamente modificati in modo tale da poter veicolare il loro genoma all’interno delle cellule bersaglio, senza dare malattia.

5. VETTORI VIRALI • I virus hanno un'ottima tendenza ad infettare le cellule ed ad inserirvi il proprio DNA sia integrandolo sia sotto forma d'episoma. • Rispetto ai sistemi di trasferimento non virali, quindi, hanno un'efficienza nettamente maggiore. • I virus attualmente studiati quali vettori per la terapia genica sono • Retrovirus • Adenovirus • Virus AdenoAssociati • Si ottengono inserendo il gene di interesse nel genoma di diversi tipi di virus, sotto il controllo di un promotore forte. • Il virus viene reso incapace di riprodursi autonomamente, per evitare la diffusione • di virus ricombinanti (virus difettivo). A tal scopo molti geni virali dei vettori sono rimossi e sostituiti dal gene bersaglio e da elementi regolatori

6. EcoRI HindIII GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA G CTTAA AGCTT A AAGCTT TTCGAA AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA AAGCTT TTCGAA AATTC G AATTC G A TTCGA A TTCGA EcoRI EcoRI HindIII HindIII Gene target Clonaggio con doppia digestione pShuttle pShuttle DNA ligasi DNA ligasi DNA ligasi DNA ligasi pShuttle + Gene target

7. Vettori virali • Virus difettivi: possono essere prodotti solo grazie a particolari linee cellulari capaci di complementare i difetti del virus. La loro preparazione deve seguire queste fasi obbligate: • Costruzione del genoma ricombinante • 2. Trasfezione del DNA nella linea cellulare capace di • produrre le particelle virali (linee di packaging) • 3. Raccolta e analisi del virus

8. Vettori virali: caratteristiche principali • Retrovirus : Sono stati i primi virus ad essere studiati per la terapia genica. Possono infettare solo cellule in divisione e si integrano stabilmente in maniera casuale. • Lentivirus : derivati del virus dell'HIV, possono infettare cellule quiescenti e si integrano stabilmente in maniera casuale. • Adenovirus: Sono espressi ad alti livelli, non si integrano stabilmente e danno grosse reazioni immunitarie. • Virus adeno-associati (AAV): integrazione sito specifica ed espressione stabile nel tempo, difficile produrli ad alto titolo. Non causano patologie.

9. Retrovirus • I retrovirus presentano due filamenti di RNA complessati con varie proteine, un capside ed un involucro lipidico (envelope). Possiedono una funzione di trascrittasi inversa, capace di sintetizzare una forma di DNA complementare che può integrarsi nel DNA cromosomico. • Il genoma tipico contiene tre geni: • – gag: codifica per le proteine strutturali • – pol : codifica per gli enzimi trascrittasi inversa, • proteasi e integrasi • – env: codifica per le proteine di membrana • – Psi (ϕ):Sequenza necessaria per il packaging (impacchettamento) • Ad ognuna delle due estremità esiste un segmento di DNA, formato dalle unità ripetitive terminali o LTR. • Queste unità LTR agiscono come promoter, regolando l’espressione dei geni virali ed • inoltre permettono al virus di integrare il proprio genoma entro i cromosomi delle cellule infettate. • I vettori retrovirali possono veicolare inserti di DNA lunghi sino a 8kb.

10. Ciclo vitale di un Retrovirus • • Il retrovirus si lega a specifici recettori situati sulla membrana cellulare della cellula ospite (il recettore CD4 della superficie cellulare e recettore delle chemochine a sette domini transmembrana associato a G protein). • Si ha quindi la fusione dell’involucro lipidico virale con quello della cellula, e il virus viene rilasciato nel citoplasma e l’RNA viene liberato • dall’involucro capsidico. • • L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA • in DNA a doppio filamento nel citoplasma • della cellula infetta. • • Il DNA lineare migra nel nucleo e viene • integrato nel DNA della cellula ospite • mediante l’enzima integrasi prodotto • dal virus. Il DNA integrato è chiamato • provirus. • • L’apparato della cellula ospite trascrive • il provirus producendo RNA virali che saranno • incapsidati nei nuovi virioni.

11. Virus difettivo integrato Gag Pol Env Psi - LTR Plasmide Gene Psi + LTR Virus difettivo integrato Gag Pol Env Psi - Particelle virali ricombinanti LTR Gene LTR Psi + Vettori retrovirali difettivi per replicazione Linea cellulare di packaging: Fibroblasti 3T3 murini

12. Lentivirus • I Lentivirus sono una sotto-classe di retrovirus di cui condividono la morfologia ed il ciclo replicativo ma a differenza dei precedenti, possono infettare ed integrarsi anche in cellule quiescenti • Hanno una struttura più complessa: • – oltre ai geni gag, pol ed env, il genoma contiene due geni regolatori , tat e rev essenziali per il controllo dell’espressione genica, ed un numero variabile di geni accessori. • Derivano dal virus dell'HIV opportunamente modificato per garantire la sicurezza del ricevente.

13. I Retrovirus nella terapia genica • Vantaggi • • Il DNA del vettore si integra stabilmente nel genoma • • Il gene terapeutico viene trasmesso alle cellule figlie in seguito a divisione cellulare. • Limiti • • L’infezione delle cellule richiede la replicazione cellulare, cosa che esclude il loro utilizzo nella cura delle patologie che interessano i tessuti non in divisione come quelle del sistema nervoso. • • Si integrano nel genoma cellulare in modo relativamente casuale, provocando inserzioni mutageniche con potenziale danno alle cellule • • La loro produzione è estremamente costosa • La semplice iniezione dei vettori retrovirali non è sufficiente per una terapia genica in vivo, perchè essi vengono uccisi dal sistema Immunitario umano mediante l'attivazione del complemento.

14. Adenovirus • L’adenovirus è un patogeno naturale dell’uomo con un genoma a DNA a doppio filamento. • Ad oggi se ne conoscono ben 51 sierotipi, in grado di infettare 6 diverse specie, causando un’ampia gamma di patologie diverse, da malattie respiratorie a congiuntiviti, a gastroenteriti. • I vettori adenovirali possono essere prodotti con titoli elevatissimi e solitamente accettano inserti grandi sino a 7-8kb. • L'ingresso nelle cellule avviene mediante endocitosi mediata da recettori, • ma il DNA inserito non sembra integrarsi e quindi l'espressione dei geni inseriti può essere mantenuta solo per brevi periodi. • Può infettare molti tipi di cellule

15. Tutti gli adenovirus hanno una simmetria icosaedrica Struttura • Essi sono composti da 252 • capsomeri di cui 240 esoni • e 12 pentoni al vertice dell’icosaedro • Una glicoproteina (Fibra) protrude dal centro del pentone. Essa è responsabile dell’attacco del virus al recettore della cellula ospite.

16. Genoma Il genoma degli adenovirus è apprissimativamente di 36 kb Sono individuabili regioni codificanti per geni espressi precocemente (early, E) e tardivamente (late, L). Ai due lati del genoma si trovano le cosiddette sequenze terminali invertite (ITR, Inverted Terminal Repeat) le quali sono necessarie per la replicazione del virus. Nel nucleo cellulare vengono espressi per primi i geni E1 (detti precoci immediati) che permettono la transattivazione dei geni E2 ed E4 che determinano il blocco della sintesi proteica cellulare e partecipano alla replicazione del DNA virale. Una volta che è iniziata la replicazione, vengono attivati i geni tardivi che codificano per le proteine strutturali che nel nucleo cellulare si assemblano intrappolando il DNA dell'adenovirus virale. genoma virale VA Y E1A/B ITR E2B E4 ITR E3 L1 L2 L3 L4 L5

17. Ciclo vitale di un Adenovirus Cell membrane CAR Integrin lysosome Receptor-mediated endocytosis Endosomal escape Viral gene transcription Nucleus Microtubules Dynein Cytoplasmic transport • Il legame dell’adenovirus alla superficie cellulare avviene in due fasi: • - Le proteine della fibra virale interagiscono con il recettore CAR • (recettore degli adenovirus coxsackie). • - La regione RGD del pentone interagisce con alcune integrine di membrana (53 o 55) • Il legame promuove • l’internalizzazione per • endocitosi mediata da • recettore in una vescicola • ricoperta da clatrina. • Il virus lisa la vescicola • endosomiale • il capside rilascia il genoma • a DNA nel nucleo.

18. VETTORI ADENOVIRALI VA Y ITR E1A/B E2B E4 ITR E3 L1 L2 L3 L4 L5 genoma virale vettore navetta transgene Y ITR E1A/B genoma virale VA Y ITR E2B E4 E3 ITR transgene L1 L2 L3 L4 L5 vettore adenovirale • Inserimento del gene terapeutico mediante ricombinazione omologa • (quantità massima di DNA trasportato : 8 kb) • Gli adenovirus ricombinanti usati come vettori presentano una delezione almeno della regione E1 il che rende il virus difettivo per la replicazione ricombinazione

19. VETTORI ADENOVIRALI Generalmente gli adenovirus ricombinanti presentano una delezione sia della regione E1 che di quella E3. Si è visto, però, che talune cellule infettate da questo vettore esprimono i geni rimanenti in quantità basse, ma sufficienti ad evocare una risposta citotossica in grado d'eliminarle. Studi successivi hanno permesso d'ottenere vettori ricombinanti aventi anche una delezione delle regioni E2 o E4 ma ciò ha determinato una riduzione dell'espressione genica.

20. VETTORI ADENOVIRALI HD loxP Y transgene promoter vettore navetta VA Y E2A/B ITR E4 ITR L5 L1 L2 L3 L4 genoma virale plasmidico ricombinazione in cellule 293 VA Y ITR E4 E2A/B promoter transgene ITR L5 L1 L2 L3 L4 taglio mediato da Cre Y E2B ITR transgene ITR promoter Attualmente si è ottenuta una terza generazione di vettori ricombinanti (Helper Dependent o anche high Capacity) in cui tutti i geni virali sono stati eliminati e sono rimaste solamente le regioni ITR e la sequenza di packaging a fianco del gene d'interesse. La produzione di questo tipo di virus utilizza cellule trasfettate stabilmente con E1 ed una ricombinasi chiamata CRE, che è in grado di tagliare il segnale di impacchettamento del virus helper contente tutti i geni virali tranne E1, e che ha la funzione di provvedere alla trascrizione di tutte le proteine del capside del vettore helper dependent. Il virus helper al contrario non può impacchettarsi in quanto mancante del segnale di impacchettamento poiché exciso dalla proteina CRE.

21. Gli Adenovirus nella terapia genica Vantaggi • Largo numero di tipi cellulari bersaglio ed alta efficienza . • Non richiede che la cellula ospite sia in divisione. • Il DNA virale esiste come episoma e non si incorpora stabilmente nel genoma delle cellule bersaglio, eliminando così il rischio di cancerogenesi. Limiti • Rapida inattivazione delle cellule infettate dall’adenovirus. • Avviene una progressiva perdita dell’episoma che porta generalmente ad una espressione transitoria.

22. Virus Adeno-associato (AAV) • I virus adeno-associati sono virus umani non patogeni che appartengono alla classe dei parvovirus (piccoli virus a DNA a singolo filamento). • Il virione è molto piccolo e privo di un involucro lipidico. • Le ridotte dimensioni del virione non permettono l’inserimento di DNA esogeno di lunghezza superiore a 4 Kb e questo comporta notevoli limitazioni al loro utilizzo. • Ad oggi ne sono stati descritti 11 sierotipi, in grado di infettare cellule di diversi tessuti, anche non attivamente proliferanti.

23. Struttura Il loro genoma è costituito da un singolo filamento di DNA costituito da due geni: Rep che codifica per le proteine implicate nella replicazione e nell'integrazione Cap per le proteine del capside. A ciascuna estremità vi è una sequenza regolatoria terminale ripetuta, ITR (inverted terminal repeats), di 145bp contenente un promotore. Quando tale virus viene utilizzato come vettore, i due geni rep e cap vengono sostituiti con il gene di interesse e le regioni regolatrici ad esso correlate.

24. Ciclo vitale di AAV Gli AAV sono incapaci di replicare autonomamente: Il loro ciclo vitale richiede la presenza di un virus di dimensioni superiori (virus helper), quasi sempre un adenovirus o un herpes virus. In assenza del virus helper, l’AAV si integra in una regione ben precisa sul cromosoma 19 ed esprime i suoi geni a livelli molto bassi, infettando la cellula in modo latente. Se questa cellula viene poi infettata da un virus “helper”, il genoma dell’AAV viene estratto dal DNA genomico e replicato, le proteine virali vengono prodotte ad alti livelli, avviene l’assemblamento delle particelle virali e il loro rilascio. Il vettore basato sui virus adenoassociati ricombinanti è costruito sostituendo il gene terapeutico a cap e rep. La produzione d'un simile vettore la si ottiene trasfettando una linea cellulare (HEK293) con un plasmide contenente i geni cap e rep e Successivamente infettandola con un adenovirus helper difettivo per E1.

25. I Virus AdenoAssociati nella terapia genica • Vantaggi • • Non causano infiammazioni e non sono responsabili di nessuna patologia che colpisca l’uomo. • • Mancanza di reazioni immunitarie → questi virus danno luogo ad un'espressione • genica a lungo termine e con un elevato grado di sicurezza. • Normalmente il virus non modificato si integra nel genoma della cellula bersaglio ad uno specifico locus del cromosoma 19, eliminando così il rischio di inserzioni casuali. • Limiti • • Hanno una ridotta capacità a trasportare geni estranei (solo 4 kb, la metà rispetto agli adenovirus).