Analisi microbiologica dei campioni

1. 4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo 1 ml 1 ml 1 1 ml Sospensione di terreno 2 1 ml 10-1 3 1 ml 10-2 4 1 ml 10-3 5 1 ml 6 10-4 10-5 7 8 10-6 10-7 10-8 Valori in difetto Valori in eccesso Analisi microbiologica dei campioni Metodi di rilevamento Il numero delle cellule microbiche nel suolo può essere determinato: Tecnica del vetrino interrato Se la superficie del vetrino è pulita, non è selettiva, e agisce come le particelle minerali del suolo Metodo delle diluizioni di sospensioni di suolo Conte dirette al microscopio ottico o all’epifluorescenza o elettronico a scansione

2. Il numero dei batteri calcolato con metodi colturali è di circa 106-108 batteri per grammo di terra secca, mentre quello ottenuto per microscopia diretta è di circa 10-100 volte superiore. Conte dirette I valori sono approssimati per eccesso in quanto vengono calcolate anche le cellule morte Colorazioni vitali Permettono di distinguere le cellule ancora in grado di respirare da quelle che non metabolizzano più.

5. Hemolysis

6. Subito dopo l’inoculo si depongono sulla superficie della piastra una serie di dischetti di carta assorbente sterili imbevuti di adatte concentrazioni degli antibiotici che si desidera testare.  • Si divide la piastra in spicchi, uno per ciascun antibiotico, e si deposita al centro di ogni spicchio il dischetto corrispondente, con l’aiuto di una pinzetta sterile. • Si pongono le piastre in incubatore a 37°C per 18-24 ore. • Si misura il diametro degli aloni di inibizione per ogni antibiotico.

7. a) Preparare 500 ml di soluzione fisiologica (NaCl 9‰ in H2O deionizzata). Distribuire come al punto b e versare il rimanente in una beuta da 1000 ml, sterilizzare c) Sterilizzare alcune provette vuote da 22mm per le diluizioni Sospensione e serie delle diluizioni 1)Preparazione del materiale b)Preparare una beuta da 250 ml con 95 ml di soluzione fisiologica, alla quale si aggiungano circa 100 palline di vetro, sterilizzare

8. b) Mettere la beuta ad agitare per 15 minuti 9 ml c) Distribuire sterilmente 9 ml di soluzione fisiologica in 5 provette sterili 1 ml 1 ml d) Fare le diluizioni: prelevare 1 ml di soluzione dalla beuta di partenza (diluizione10-1) e metterlo in una provetta contenente 9 ml di soluzione fisiologica; procedere in successione fino ad ottenere la diluizione 10-6 9 ml Diluizioni seriali 2) Sospensione del campione e diluizioni seriali a) Prelevare 5 grammi dal campione mediato e metterli nella beuta sterile contenente la soluzione fisiologica e le palline di vetro. In questo modo si ottiene la diluizione 10-1

9. 3) Conta su piastra a) Per i funghi, dalle diluizioni 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 prelevare sterilmente 0,1 ml, versarlo sulla piastra e spargere la coltura con un'ansa sterile b) Per i batteri, procedere allo stesso modo ma considerare le diluizioni 10-3, 10-4, 10-5; 10-6 c) Inoculare 3 piastre per ciascuna diluizione, sia per la conta dei funghi che per la conta dei batteri Aggiungere una o due piastre di controllo per ciascun terreno, inoculate con soluzione fisiologica sterile N.B. Ricordarsi di indicare su ciascuna piastra il tipo di terreno utilizzato specifico per batteri o funghi, il campione, la diluizione e la data. d) Incubare a 28°C per circa una settimana; procedere con la conta delle colonie cresciute sulle piastre inoculate e registrare i dati raccolti per la successiva elaborazione

10. Assorbanza g/ml proteine 5.Ciclo dell’azoto Analisi di attività batteriche Dosaggio di proteine in una coltura batterica Lowry et al. (1951)  Preparazione del materiale Soluzioni NaOH 1 N NaOH 0,1 N Na2CO3 2% in NaOH 0,1 N CuSO4•5H2O 1% in H2O distillata Tartrato di sodio 2% in H2O distillata o potassio Prima di procedere al dosaggio delle proteine in una coltura batterica è necessario disegnare su carta millimetrata la curva di taratura utilizzando una soluzione a concentrazione nota di Albumina

11.  Idrolizzare i campioni nel modo seguente: centrifugare per 20 minuti a 10000 giri/min 3 ml di coltura batterica risospendere il pellet in 3 ml di soluzione NaOH 1N prelevare (in doppio) 1 ml della sospensione ottenuta e metterlo in una provetta di vetro;chiudere ciascuna provetta con carta d’alluminio mettere le provette a bollire per 10 minuti

12.  Proseguire con il metodo di Lowry per la determinazione delle proteine:  preparare la miscela di reazione nella quantità necessaria, mescolando con le seguenti proporzioni le soluzioni: Na2CO3 10 ml CuSO4 5 H2O 0,1 ml Tartrato di sodio o potassio 0,1 ml  prelevare dalle provette del campione bollito 0,8 ml e metterli in un’altra provetta  aggiungere 4 ml della miscela di reazione  lasciare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti  aggiungere 0,4 ml di reagente Folin e mettere le provette al buio per 30 minuti

13. Assorbanza g/ml proteine leggere l’assorbanza allo spettrofotometro ad una lunghezza d’onda di 500 nm  valutare la quantità di proteine dei campioni dalla curva di taratura N.B. La lettura del campione allo spettrofotometro deve essere fatta contro un bianco (H2O) sottoposto alle stesse reazioni del campione

15. Controllo dello sviluppo microbico • Per controllo dello sviluppo microbico si possono intendere diverse cose: si può volere inibire e non uccidere i microrganismi, oppure si vuole eliminare totalmente la popolazione microbica su soggetti inanimati o su superfici viventi. • Si usano diversi metodi e diverse terminologie ne indicano le finalità.

16. Controllo dello sviluppo microbico • Sterilizzazione: è il processo in cui vengono distrutte o rimosse tutte le cellule viventi (includendo le spore, i virus e i viroidi) da un determinato habitat o da oggetti inanimati; • Disinfezione: uccisione o inibizione di soli microrganismi patogeni e disinfettanti sono gli agenti chimici che vengono usati nei processi di disinfezione; • Sanificazione: la carica microbica viene ridotta entro limiti considerati sicuri per gli standard di sanità pubblica;

17. Controllo dello sviluppo microbico • Antisepsi: è la pratica in grado di prevenire una infezione e si dicono antisettici i composti chimici utilizzati; • Antibiotici e chemioterapici: rientrano nelle categorie dei composti in grado di controllare lo sviluppo microbico.

18. Il modello di morte microbica • La distruzione di una popolazione microbica non avviene istantaneamente con l’esposizione ad un agente letale. • Dopo che la popolazione ha subito una marcata riduzione, il tasso di mortalità rallenta e ciò consente la sopravvivenza di ceppi microbici più resistenti. • E’ molto difficile stabilire il punto di morte dei microrganismi: quando avviene? Generalmente quando una cellula, inoculata in brodo fresco, non dà più origine ad una progenie.

26. ….by manu!!!

27. MICROBIOLOGIA AMBIENTALE PANORAMA sulle TECNICHE “CLASSICHE E MOLECOLARI”

28. Diversità morfologica dei microrganismi MORFOLOGIA CELLULARE OSSERVABILE AL MICROSCOPIO

29. Diversità morfologica dei microrganismi • Numero e disposizione dei flagelli in rapporto alla cellula Monotrico Anfitrico • Flagello/i: • non visibile al microscopio!!! Lofotrico Peritrico MORFOLOGIA CELLULARE

30. Microscopia ottica ed elettronica MICROSCOPIA = insieme delle tecniche legate all’osservazione di organismi microscopici

31. Microscopia ottica ed elettronica

32. Microscopia ottica ed elettronica Oculare Fascio di elettroni Lente magnetica Obiettivo Campione Lente obiettivo Campione Lente proiettore Fonte luminosa Microscopia ottica Immagine schermo fluorescente Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

33. Microscopia ottica ed elettronica • Concetti chiave • Ingrandimento. • 2. Potere risolutivo: capacità di mostrare due punti adiacenti come distinti. • - occhio umano 75-100 m; • - microscopio ottico: 0.2 m (200 nm); • - microscopio elettronico: 0.2-2 nm. • Il potere risolutivo dipende dalla caratteristiche fisiche del mezzo • (luce-fascio di elettroni).

34. OBIETTIVO 10X OBIETTIVO 40X OBIETTIVO 100X Vite macrometrica MESSA A FUOCO Vite micrometrica Schema: microscopio composto OCULARE- GENERALMENTE BINOCULARE !! Tubo metallico Ruota obiettivi Braccio Tavolino Porta campione Ganci Condensatore Diaframma Sorgente di luce Base microscopio

35. Principi di base: microscopio composto • Sistema di lenti convergenti: • Oculare ed 2. Obiettivo all’estremità di un tubo metallico (160 mm) • Campione (oggetto) davanti l’ obiettivo → immagine reale-capovolta ed ingrandita • - Immagine reale, capovolta ed ingrandita davanti all’oculare →immagine virtuale, capovolta ed ingrandita

36. Principi di base: microscopio composto INGRANDIMENTO FISSO 10X oculare 10X, 40X,100X obiettivi Ingrandimento totale= Ingr. oculare X Ingr. obiettivo OBIETTIVO ED OCULARE LAVORANO INSIEME PER RISOLVERE L’IMMAGINE L’oculare “risolve” l’immagine “reale” risolta dall’obbiettivo

37. Microscopio composto: obiettivo 100X ad immersione • L’obiettivo 100X è sempre • ad immersione; • L’obiettivo 100X è retrattatile; • L’olio ha lo stesso indice di rifrazione • del vetro dell’obiettivo .

38. Osservazione in vivo e le colorazioni • Osservazione in vivo: • - vetrino + goccia campione+ coprioggetto; • - vetrino + goccia campione + inchiostro di china+ coprioggetto; • - vetrino + goccia campione+ coprioggetto. • 2. Le colorazioni. I coloranti sono composti organici con differenti affinità • per specifiche componenti cellulari. • Distinguiamo : • A: Coloranti cationici (basici) [ strutture cellulari cariche negativamente, acidi nucleici e • polisaccaridi acidi, COO-] : • blu di metilene, safranina e cristal violetto. B. Coloranti anionici: (acidi )[ strutture cellulari citoplasmatiche]. Eosina, Rosso congo, Fucsina acida.

39. Biologia molecolare (?) Esami colturali Colorazione di Gram Esami in laboratorio

40. Fasi della colorazione Colorazione di Gram Struttura della parete Gram-positivi Gram-negativi

41. Esame colturale per batteri Gram-negativi • agar McConkey (Enterobatteri) • agar sangue (G. vaginalis) • agar cioccolato (Gonococco) Gram-positivi • agar sale mannite (Stafilococchi) • agar sangue (Streptococchi )

42. Colorazione di Gram • 1884 Hans Christian Gram • Tecnica basata sulle proprietà fisiche della pareta cellulare

43. Identificazione microbica Batteri Gram-negativi Indolo e/o Mobilità in SIM agar Prove biochimiche:TSI agar Gallerie API 20 E Gallerie API 20 NE Gallerie API NH

44. Identificazione microbica Staphylococcus aureus Mannite+ e Coagulasi+ Test coagulasi Test catalasi Gallerie API Staph (bioMérieux)

45. Lieviti: esame colturale Sabouraud dextrosio agar (Incubazione a 37° per 2-5 gg)

46. Colorazione di Gram Asciugare all’aria Fissare alla fiamma RISULTATO AL MICROSCOPIO?

47. Colorazione di Gram Quali sono Gram positivi e quali Gram negativi?

48. Colorazione di Gram

49. …“ma…” La colorazione di GRAM è molto utilizzata in microbiologia clinica, ma poco sfruttabile in microbiologia ambientale

50. Microscopia ad epifluorescenza SYBR-GREEN Labels double DNA strain DAPI A simple-to-use fluorescent stain, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), visualizes nuclear DNA in both living and fixed cells • Confocal microscope images of colonized glass beads. Diatoms (Navicula sp. • 1) are seen by the red fluorescence of their chloroplast. • Bacteria (P. haloplanktis) are stained with SYBR Green 1. • and (d) Diatoms alone; (b) and (e) P. haloplanktis added to the diatom • culture after 4 d; (c) and (f) P. haloplanktis added to diatom culture • at time zero. Upper panel magnification was 10006 × , lower panel • magnification was 23006 ×.