ESPERIMENTO

1. ESPERIMENTO TRASFORMAZIONE BATTERICA

2. OBIETTIVO Trasferire un gene proveniente dalla medusa tropicale “Aequoria Victoria” che codifica per una particolare proteina detta GFP (Green FluorescentProtein) che fornisce una colorazione verde fluorescente, all’interno dei batteri denominati Eschierica Coli per mezzo di un carrier (vettore) costituito da un plasmide.

3. Escherichia Coli Escherichia coli è un gene di batterio gram-negativo (cioè negativo alla colorazione di Gram) a forma di bastoncello. Poiché la sua temperatura ottimale di sopravvivenza è di 37 °C, vive facilmente nell’intestino dell’uomo e degli animali, è poco resistente a disinfettanti chimici e/o fisici e viene distrutta con la pastorizzazione.

4. PLASMIDI • Molecole di DNA circolare a doppio filamento • Hanno lunghezze variabili da uno 1Kb a 20Kb • Presenti in numero variabile di copie nella cellula batterica • Si replicano in modo indipendente dal DNA genomico del batterio • Spesso contengono geni che conferiscono un vantaggio ai batteri che li possiedono (resistenza ad antibiotici, produzione di batteriocine in grado di uccidere altri batteri ecc…)

5. PLASMIDE pGLO Operone Arabinosio Origine della replicazione per consentire la duplicazione del plasmide all’interno della cellula Gene della medusa Resistenza all’ antibiotico Ampicillina

6. LE FASI DEL PROTOCOLLO • Trattamento con CaCl2 per rendere i batteri competenti • Shock termico – Inserimento del plasmide • Aggiunta di terreno di coltura liquido ed incubazione • Semina di piastre con terreni selettivi • Incubazione overnight • Osservazione dei risultati

7. Viene fornita una provetta contenente batteri congelati e già trattati con CaCl2. Mettere la provetta Eppendorf marcata con il + nel bicchiere con il ghiaccio. Aggiungere 8 μl di batteri competenti sul fondo della provetta +. Aggiungere sul fondo della stessa provetta 2 μl di plasmide pGLO.

8. Prendere la provetta e inserirla per 1 minuto e 30’’ in un bagnetto termostatato a 42°C, perché lo sbalzo repentino di temperatura favorisce ulteriormente l’apertura dei pori della parete.

9. Aggiungere alla provetta 200 μl di un Brodo contenente sali e sostanze nutritive per i batteri. Questo consente ai batteri di crescere e riprodursi per mezzo della scissione binaria, che porta alla clonazione di un batterio ogni 20 minuti.

10. Inserire le provette all’interno della stufa per circa 20/30 minuti e regolate la temperatura a 37°C per consentire ai batteri di duplicarsi.

11. Preparare le piastre Petri, predisponendo i vari terreni nei quattro settori. Primo Settore: terreno di coltura costituito da brodo con l’aggiunta dell’addensante agar-agar, per rendere il composto gelatinoso; Secondo settore: terreno costituito dall’antibiotico Ampicillina e dal brodo di coltura Terzo settore: terreno costituito dall’antibiotico Ampicillina e dal brodo di coltura Quarto settore: terreno costituito da brodo di coltura, Ampicillina e Arabinosio.

12. Trasferire 100 μl di soluzione nei vari settori della piastra Petri, far riposare per una notte e osservare i risultati ottenuti, sfruttando una lampada che emette luce ultravioletta.

13. OSSERVAZIONE DEI RISULTATI

14. Nel Primo settore si creerà una colonia di batteri grazie alla presenza del brodo di coltura, ma non fluorescenti in quanto non si tratta dei batteri trasformati. Nel Secondo settore tutti i batteri risulteranno morti in quanto, essendo privi della resistenza all’antibiotico fornita dal plasmide, verranno uccisi dall’Ampicillina. Nel Terzo settore i batteri trasformati formeranno delle colonie puntiformi, ma non risulteranno verdi fluorescenti, poiché non viene attivato l’interruttore genetico che avvia la produzione della proteina GFP. Nel Quarto settore i batteri creeranno delle colonie che risulteranno verdi fluorescenti alla luce ultravioletta, poiché grazie alla presenza dell’Arabinosio nel terreno viene avviata la produzione della GFP.