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Milena Peixoto do Valle Mestranda em Endocrinologia Genética Faculdade de Medicina da USP

Milena Peixoto do Valle Mestranda em Endocrinologia Genética Faculdade de Medicina da USP. Ensaio de biossensores.

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Milena Peixoto do Valle Mestranda em Endocrinologia Genética Faculdade de Medicina da USP

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Presentation Transcript

  1. Milena Peixoto do Valle Mestranda em Endocrinologia Genética Faculdade de Medicina da USP

  2. Ensaio de biossensores • Sistemas de sensores de DNA se baseiam na imobilização da sonda fita simples de DNA (ssDNA) na superfície da nanopartícula, que reconhece a complementariedade da sequência do DNA alvo (tDNA) por hibridização do DNA. • A hibridização pode ser mensurada eletronicamente, opticamente, eletroquimicamente ou usando um dipositivo sensível de massa.

  3. Códigos-de-barras de DNA • São regiões de sequência de DNA curtas (menos de 800 pares de base) que apresentem variabilidade suficiente para discriminar espécies • Um ensaio de código de barras de DNA utiliza oligonucleotídeos modificados em nanopartículas (AuNPs) para amplificação do sinal e nanopartículas magnéticas (MNPs) para facilitar a separação do complexo de nanopartículas da amostra.

  4. B

  5. Objetivo: Conseguir detectar e identificar a presença do gene do “antígeno A” (pagA) - Bacillus anthracis e o gene “elemento de inserção” (Iel) de Salmonella enteritidis simultaneamente. Componentes: • O sistema de biosensores é composto por três nanopartículas: nanopartículas de ouro (AuNPs), nanopartículas magnéticas (MNPs), e nanopartículas rastreadoras (NTs, como PbS, CdS e ZnS).

  6. Vantagens • Sobre a abordagem com ensaios de barcode DNA (bDNA) , esta técnica teria vantagens sobre a detecção óptica , muito usada em ensaios com nanopartículas, que ocupam muito espaço físico. • O requerimento de espaço físico pode ser minimizado utilizando o sistema eletroquiímico para diagnósticos biomédicos proposto, que pode ser integrado a micro sistemas, incluindo o processamento do sinal. • No entanto , sistemas portáteis que poderiam ser utilizados em campo, ainda estão sendo desenvolvidos.

  7. Metodologia --- Amostras • Culturas - Bacillus anthracis e Salmonella enteritidis • Miniprep • PCR pagA(B. anthracis) e Iel (S.enteritidis) • Eletroforese • Purificação • Diluições em H2O • [tDNA] confirmadas por espectrofotômetro

  8. Medodologia ---Construção das nanopartículas Oligonucleotídeos thiolados foram conjugados às nanopartículas: Para a detecção do S. enteritidis pelo gene insertion element (Iel) • A primeira sonda de DNA (1pDNA) na AuNPs: 5-AATATGCTGCCTACTGCCCTACGCTT-SH-3’; • A segunda sonda de DNA(2pDNA) nas MNPs: 5-SH-TTTATGTAGTCCTGTATCTTCGCCGT-3’. Para a detecção do gene pagA do B. anthracis • A primeira sonda de DNA (1pDNA) na AuNPs : 5-SH-GGAAGAGTGAGGGTGGATACAGGCT-3’; • A segunda sonda de DNA(2pDNA) nas MNPs : 5-AGATTTAAATC TGGTAGAAAGGCGG–SH-3 -bDNA nas AuNPs para detectar ambos os genes : 5-NH2-TTATTCGTAGCTAAAA AAAAAA-SH-3’

  9. A dimensão e as propriedades espectroscópicas das AuNPs e dos NTs foram caracterizadas pela TEM (Transmission Electron Microscope).

  10. Medodologia ---Construção das nanopartículas • Às MNPs foram adicionadas as 2pDNA respectivas para cada gene (pagA e Iel). • Às AuNPs, foram adicionados o bDNA juntamente à 1pDNA na proporção 100:1 (complexo estável a TA). • A esse conjugado são adicionado os NTs específicos para cada 1pDNA (pagA e Iel).

  11. Conjugação das NTS aos AuNPs A- bio bDNA + NTs + crosslinkers B- bio bDNA + NTs C- CdS NTs

  12. Ensaio Diluições de [tDNA] Foram adicionadas as MNP-2pDNA Formação do complexo MNP-2pDNA/tDNA – lavagem Adicionado o complexo 1pDNA-AuNP-bDNA-NTs Formado o complexo MNP-2pDNA/tDNA/1pDNA-AuNP-bDNA-NTs Aplicação do complexo ao campo magnético – 5 lavagens O sanduíche lavado foi dissolvido em ácido nítrico que libera os íons NTs (Pb2+ ou Cd2+). Depois é acrecentada uma solução ácida com bismuto que permite a mensuração etroquímica dos NTs .

  13. Square-Wave Anodic Stripping Voltammetry (SWASV)

  14. Razões para o deslocamento do pico: -DDP Ag/AgCl -SPCE diferentes

  15. Pb Cd ? -0,61 -0,87 “The possible reason would be that the washing steps were not thorough and the unreacted PbS NTs generated the noise.”

  16. Cd/Salm. Pb/Antr. -0,87 -0,61

  17. B. anthracis, Pb ( −0.61V) (tDNA-50 ng/mL, 5 ng/mL, 500 pg/mL, e50 pg/mL) são 38uA, 34uA, 29.5uA, and 23uA, respectivamente. S. enteritidis, Cd(−0.87V) (tDNA-50 ng/mL, 5 ng/mL, 500 pg/mL, and 50 pg/mL) são 42.5uA, 35uA, 32uA, e 27uA, respectivamente

  18. Conclusões • A conjugação dos grupos carbolixílicos nos NTs e a conjugação dos grupos amino nos bio-barcoded AuNPs foi eficiente. • Após mixar as nanopartículas com o tDNA o sanduíche estrutural (MNP-2pDNA/tDNA/1pDNA-AuNP-bDNA-NTs) foi formado. • Os sinais eletroquímicos emitidos pelos NTs liberados aumentam com o aumento da [tDNA]. • O biossensor tem boa especificidade e sensibilidade na detecção individual do gene pagA de B. anthracis usando PbS NTs na concentração mínima de 0.2 pg/mL. • O limite da detecção deste sensor multiplex bio-barcoded DNA é 0.5 ng/mL para o gene “insertion element “(Iel) de S. enteritidis utilizando CdS, e 50 pg/mL para ogene “pagA” de B. anthracis utilizando PbS NTs. • O sensor de código de barras baseado nas nanopartículas tem potencial para aplicação da múltipla detecção de agentes de bioterrorismo, co – infeção, e múltiplos contaminantes numa mesma amostra...

  19. FIM

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