J. Kolář - Biologické rytmy a fotoperiodizmus rostlin

1. J. Kolář - Biologické rytmy a fotoperiodizmus rostlin 7: Evoluce cirkadiánní rytmicity

3. Cirkadiánní oscilátory různých skupin organizmů • základní vlastnosti cirkadiánních rytmů jsou stejné u všech organizmů - sdílejí společné rysy i jejich cirkadiánní oscilátory? • u oscilátorů nás především zajímá: Kde jsou v organizmu? a Z čeho se skládají? • srovnání jejich lokalizace a struktury u modelových druhů z různých taxonů může objasnit evoluci cirkadiánní rytmicity a také např. pomoci při volbě vhodné strategie pro hledání složek oscilátoru u dalších organizmů • v současnosti je podrobněji známa molekulární podstata cirkadiánního oscilátoru u sinice Synechococcus elongatus, vřeckovýtrusé houby Neurospora crassa, rostliny Arabidopsis thaliana a dvou živočichů - octomilky Drosophila melanogaster a laboratorní myši

4. Lokalizace cirkadiánních oscilátorů u živočichů • živočichové mají centrální oscilátor(y) v různých oblastech mozku, v očích apod. • například u savců je jeden oscilátor v suprachiazmatickém jádře hypotalamu (SCN), u ptáků jsou oscilátory v očích, SCN a epifýze - jejich relativní důležitost je druhově specifická • zničení oscilátoru vyvolá ztrátu rytmicity organizmu léze SCN vlevo: pohybová aktivita křečka s lézí SCN (Stetson a Watson-Whitmyre 1976) vpravo: pohybová aktivita vrabce s odstraněnou epifýzou (Binkley 1993) změna režimu z LD 14:10 na DD

5. Lokalizace cirkadiánních oscilátorů u živočichů • autonomní oscilátory byly objeveny také v periferních orgánech a i v izolovaných buňkách! • centrální oscilátory živočichů proto zřejmě slouží především k synchronizaci periferních oscilátorů rytmy hladiny cirkadiánně regulované mRNA, měřené pomocí luminiscence v řezech z orgánů myši kultivovaných in vitro (Yoo et al. 2004)

6. Lokalizace cirkadiánních oscilátorů u rostlin • cirkadiánní oscilace přetrvávají i v izolovaných orgánech, buňkách a protoplastech – každá buňka má patrně vlastní oscilátor • centrální oscilátor u rostlin nenalezen • některé experimenty ukazují, že oscilátory jednotlivých buněk jsou navzájem dost nezávislé Každá děloha semenáčku CAB::LUC tabáku byla synchronizována s jiným LD režimem (rozdíl fází 12 h) a luminiscence pak měřena v LL. Thain et al. 2000

7. Lokalizace cirkadiánních oscilátorů u rostlin • oscilátory v různých orgánech se zřejmě poněkud liší (v kořenech jen ranní smyčka?) • možná synchronizace rytmů mezi prýtem a kořeny (zprostředkováno sacharidy???) cirkadiánní oscilátory v prýtu a kořeni Arabidopsis thaliana, Más a Yanovsky 2010

8. Cirkadiánní oscilátor Arabidopsis thaliana (připomenutí z minulé přednášky) • 3 smyčky (ranní, večerní, centrální) • představa zatím není definitivní: neznámé komponenty, možná i další smyčky model cirkadiánního oscilátoru Arabidopsis thaliana, Pruneda-Paz a Kay 2010

9. Cirkadiánní oscilátor Neurospora crassa • vřeckovýtrusá houba • obvykle se sleduje dobře analyzovatelný cirkadiánní rytmus v produkci asexuálních spor (konidií): mycelium prorůstá stálou rychlostí agarem a v cirkadiánních intervalech produkuje konidie Crosthwaite 2004

10. Cirkadiánní oscilátor Neurospora crassa • hlavní složky: WC-1, WC-2 (zinc-finger transkripční faktory s PAS doménami pro meziprotei-novou interakci, WC-1 je i receptor modrého světla); FRQ (interaguje s komplexem WC-1/2), FRH (interaguje s dimerem FRQ) • možná ještě další smyčky („FRQ-less oscillators“) + FRH Crosthwaite 2004

11. Cirkadiánní oscilátor Neurospora crassa • kromě regulace transkripce jsou důležité i posttranslační regulace(hlavně fosforylace a degradace proteinů) Heintzen a Liu 2007

12. Cirkadiánní oscilátor Drosophila melanogaster • hlavní složky: Clock, Cycle (bHLH transkripční faktory, PAS domény); PER (PAS domény); TIM (dimerizuje s PER) • důležitá je regulace aktivity proteinů na úrovni fosforylace (např. inhibice Cycle/Clock) • entrainment světlem: zprostředkovaný přes CRY (kryptochrom - receptor modrého světla) + kináza Double-time Looby a Loudon 2005

13. Cirkadiánní oscilátor laboratorní myši • hlavní složky: Clock, Bmal1 (bHLH transkripční faktory, PAS domény); PER (PAS domény); CRY (zde transkripční inhibitor, ne receptor světla jako u Drosophila melanogaster) • na rozdíl od D. melanogaster dimerizuje s PER CRY, ne TIM. Další smyčky oscilátoru využívají jiné proteiny než u D. melanogaster (šedě) Looby a Loudon 2005

14. Cirkadiánní oscilátor sinice Synechococcus elongatus • hlavní složky: KaiA, KaiB, KaiC • KaiC má schopnost autofosforylace a autodefosforylace • první model předpokládal transkripční/translační smyčku jako u eukaryot Ishiura et al. 1998

15. Cirkadiánní oscilátor sinice Synechococcus elongatus • pak ale objeven posttranslační oscilátor (PTO): rytmické změny fosforylace KaiC, regulované interakcemi s KaiA a KaiB Johnson et al. 2008

16. Cirkadiánní oscilátor sinice Synechococcus elongatus • transkripční/translační smyčka (TTFL) je rychle vyhasínající oscilátor • uvnitř něj je posttranslační oscilátor (PTO) • PTO generuje robustní rytmy: nejsou ovlivněny ani dělením buněk (které výrazně mění rychlost transkripce) Johnson et al. 2008

17. Cirkadiánní oscilátor sinice Synechococcus elongatus • míra fosforylace proteinu KaiC osciluje také v systému in vitro (složky: KaiC, KaiA, KaiB, ATP), a to s cirkadiánní periodou a dokonce i s teplotní kompenzací Nakajima et al. 2005

18. Závěry z porovnání oscilátorů • každá živočišná i rostlinná buňka má zřejmě vlastní oscilátor; u živočichů jsou centrálně koordinovány, u rostlin ne (nebo málo) • oscilátory prokaryot a eukaryot jsou patrně principiálně odlišné • Jednotlivé eukaryotní říše (živočichové, houby, rostliny) mají oscilátory založené na zpětnovazebných smyčkách, z nichž aspoň jedna je negativní. Ovšem proteiny v nich zahrnuté jsou mezi říšemi příbuzné jen málo (homologie mezi WC-1 Neurospory a CYC+BMAL1 živočichů) nebo vůbec. • v rámci říší existují podobnosti ve stavbě oscilátoru (např. Drosophila a myš), ale nikoli plná konzervace složek oscilátoru a jejich regulací • V roce 2011 objeveny dva eukaryotní oscilátory, které mohou fungovat bez transkripce: nalezeny v lidských červených krvinkách a v jednobuněčné zelené řase Ostreococcus tauri. Můžeme se tedy dočkat ještě řady překvapivých zjištění.

19. Co je v eukaryotních cirkadiánních oscilátorech evolučně konzervováno? • hlavní princip: oscilátor je systém vzájemně interagujících zpětnovazebných smyček s výraz-nou rolí regulace transkripce • velká role posttranslačních modifikací proteinů (degradace závislá na ubikvitinu, fosforylace) • Některé ze zúčastněných kináz a fosfatáz jsou homologní i mezi vzdálenými taxony. Mnohé jsou ale dosti univerzální a mají v buňce řadu dalších substrátů kromě proteinů cirkadiánního oscilátoru. • PAS domény (včetně podrodiny LOV) v mnoha oscilátorových proteinech. PAS domény jsou ovšem velmi rozšířené, obecně slouží k meziproteinové interakci, hlavně při odpovědi na signály z vnějšího nebo vnitřního prostředí organizmu. PAS domény ve vybraných oscilátorových a fotoreceptorových proteinech - Looby a Loudon 2005

20. Jak mohla probíhat evoluce cirkadiánní rytmicity? • vznik několikrát nezávisle v hlavních říších organizmů; pro oscilátor pokaždé použity jiné proteiny, často takové, které se účastnily vnímání světla nebo jiných signálů z prostředí • nebo vznik pouze jednou (eventuálně dvakrát – u prokaryot a eukaryot), ovšem vývoj oscilátorů je tak rychlý, že podobnosti již nelze vysledovat • vznik pouze jednou (ev. dvakrát) a konzervováno je něco, o čem dosud nevíme nebo nedoceňujeme jeho důležitost??? Např. zatím neobjevené proteiny, regulace fosforylace atd.?