Forward Scatter (FSc) Side Fluorescence (SFl) Side Scatter (SSc);

1. Alcuni citometri a flusso utilizzano laser a semiconduttori (633 nm) e coloranti fluorescenti per acidi nucleici che separano i leucociti utilizzando i segnali di: Forward Scatter (FSc) Side Fluorescence (SFl) Side Scatter (SSc);

2. Leucocytes • Lymphocytes • Monocytes/Macrophages • Granulocytes: Neutrophils Eosinophils Basophils

3. I leucociti vengono anche differenziati sulla base della maggiore o minore quantità di mieloperosidasi (MPO) contenuta nei granuli citoplasmatici. Il sangue viene diluito, le emazie lisate e i leucociti colorati per la (MPO). Granulociti ed eosinofili = massima quantità di MPO Monociti = quantità medio -piccola di MPO Linfociti e Blasti = piccola quantità di MPO I GB: entrano in una cella di flusso in cui per ciascuna cellula vengono determinate le proprietà bi-dimensionali di dispersione e di assorbimento della luce. Le cellule colorate assorbono più luce e la disperdono con un angolo diverso rispetto alle cellule non colorate. Il risultato finale e' un citogramma leucocitario bi-dimensionale.

5. LINEE GUIDA F. LEUCOCITARIA La refertazione delle popolazioni leucocitarie deve essere espressa in numero assoluto. La quantificazione percentuale, che da sola può fornire informazioni equivoche, può talvolta integrare efficacemente il numero assoluto; pertanto, la doppia refertazione mantiene un valore informativo.

6. Lymphocytes • 1.5 - 3.5 x 109/l • Count varies with age • Adaptive immune response • T cells – cell mediated immunity • B cells – antibody mediated immunity NK cells

7. Linfocitosi • Linfociti ≥4500 cellule/l negli adulti • Linfociti ≥9000 cellule/l nei bambini fino ai 10 anni • Infezioni virali, tubercolosi ,brucellosi e tifo • Infezione da Bordetella pertussis • Linfomi

8. Linfocitopenia • Linfociti1500 cellule/l negli adulti • Linfociti 3000 cellule/l nei bambini • Immunodeficit congeniti ed acquisiti • Stress da aumentata increzione di glucocorticoidi • Aplasia midollare • Alcune forme di LLA • Immunosoppressione da farmaci

9. Monocytes 0.2 – 0.8 x 109/l • Antigen presentation • Cytokine production • Phagocytosis

10. Monocitosi • Monociti ≥ 800 cellule/l • Tubercolosi • Endocarditi batteriche acute • Brucellosi • Malaria • Morbo di Chron • Sarcoidosi • LES ed artrite reumatoide • Linfoma di Hodgkin

11. Monocitopenia • Monociti 150 cel/l • Stress da glucocorticoidi • Aplasia midollare • Leucemia a cellule capellute • Farmaci immunosoppressivi

12. Neutrophils • 2.5 - 7.5 x 109/l • Large reserve pool • 3-5 lobes • Granular cytoplasm • Transient in blood • Major phagocytic role • Bacterial killing

13. Neutrofilia • Neutrofilia ≥7500cellule/L • Infezioni batteriche – germi piogeni (ma anche fungine, parassitarie ed alcune virali) • Flogosi immuni e non immuni (ustioni ,emorragie,tumori metastatici, infarto,embolia polmonare) • Stress, Adrenalina e Glucocorticoidi • Sindromi mieloproliferative ( Leucemia mieloide cronica,mielodisplasia e policitemia vera) • Farmaci (glucocorticoidi)

14. Neutropenia • Neutropenia grave:neutrofili500 cellule/l • Neutropenia moderata: 500-1000 cellule/ l • Neutropenia lieve:1000-2000 cellule/ l • Neutropenia da farmaci (immunosoppressori e antiblastici) • Aplasia midollare, leucemie e linfomi • Neutropenia isoimmune neonatale (aumentata distruzione da IgG materne verso Antigeni paterni) • Neutropenia autoimmune (LES) • Neutropenia da aumentata marginazione (setticemia da Gram -, malaria, tifo, rickettiosi) • Neutropenia da sequestro splenico (cirrosi)

15. Hypersegmentation • Shift to the right • More mature cells kept on • Infective and inflammatory sites • Severe burns • TB, post chemo, pregnancy “Shift to the left”

16. Eosinophils • 0.2 - 0.8 x 109/l • Bilobed nucleus Red granules Weakly phagocytic • Anti-parasitic action • Modulation of hypersensitivity and allergic reactions

17. Eosinofilia • Eosinofili ≥800 cellule/l • Allergie • Infestazioni da metazoi • Farmaci • Malattie autoimmuni sistemiche • Neoplasie • Sindromi ipereosinofile

18. Eosinopenia • Eosinofili 70 cellule/l • Aumentata increzione di glucocorticoidi • Infezioni batteriche acute

19. Basophils • 0.1 - 0.2 x 109/l • Bilobed nucleus • Large black granules • Inflammatory response • Hypersensitivity /allergy

20. Basofilia • Basofili ≥ 20 cellule/ l • Ipersensibilità immediata • Colite ulcerosa • Leucemia mieloide cronica (basofila) • Policitemia vera

21. Stress Infection Steroids Cushing’s syndrome Basopenia

22. Platelets • Fragments of cytoplasm from BM megakaryocyte • Major role in coagulation

23. Platelets 2 • Lifespan in peripheral blood 7-10 days • Range 150-400x 109/l

24. METODI USATI PER IL CONTEGGIO AUTOMATICO DELLE PIASTRINE • CITOFLUORIMETRICO • IMPEDENZOMETRICO • ELETTRO OTTICO

25. Conta piastrinica Conta Ottica PLTo Conta ad impedenza PLTi

26. Metodo impedenziometrico Piastrine : Istogramma volumetrico PL = soglia inferiore, PU = soglia superiore, PDW = platelet distribution width (larghezza della curva tagliata al 20%), P-LCR = platelet –large cell ratio (percentuale di grandi piastrine). MPC= Mean PLT Contenent (misura della concentrazione complessiva dei componenti interni delle piastrine)

27. MPV • Più alto negli uomini • Correlazione inversa non lineare fra MPV e N.ro PLT • Aumenta in corso di: Diminuisce in corso di: Diabete mellito Leucemia Acuta IMA An. Megaloblastica Arteriopatie Periferiche Malattie mieloproliferative Pre-eclampsia Splenectomia

28. PDW • Indica l'anisocitosi piastrinica. Aumenta in corso di: • An. Megaloblastica • An. Aplastica • AREB • LMC • In presenza di crioglobuline e paraproteine

29. MPC E' misura della concentrazione complessiva dei componenti interni delle piastrine, fornisce indicazioni su: • Morfologia, Attivazione, Screening. Di conseguenza utile per: • monitoraggio terapie antiaggreganti • monitoraggio terapie antinfiammatorie

30. Quantitative Abnormalities 1 • Thrombocytopenia - Decreased count • <100 x 109/l - Increasing risk of bleeding in major surgery • <50 x 109/l - Increasing risk of bleeding for CID and surgery • <10-20 x 109/l - Increasing risk of spontaneous bleeding • Causes • Immune • BM infiltration, chemotherapy etc • Inherited defects

31. Quantitative abnormalities 2 • Thrombocytosis - Increased count • > 450 x 109/l • Reactive eg infection inflammation • Chronic bleeding • Haematological malignancy

32. INTERFERENZA NELLA CONTA PIASTRINICA • Frammenti eritrocitari • Frammenti di globuli bianchi • Parassiti, batteri • Ombre eritrocitarie • Piastrine giganti • Aggregati piastrinici • Effetto da anticoagulante

33. Cause più comuni di conta piastrinica erronea nel paziente ematologico AGGREGATI PIASTRINICI CAUSA FREQUENTE DI CONTA SOTTOSTIMATA Sono epressione dell’agglutinazione piastrinica in vitro da parte di autoanticorpi • IgG EDTA- e temperatura – dipendenti • Crioagglutinine EDTA – dipendenti • IgG EDTA- dipendenti e temperatura – indipendenti Gli AUTOANTICORPI EDTA – DIPENDENTI interagiscono con antigeni criptici della glicoproteina II b, smascherati dalla chelazione del calcio da parte dell’EDTA

34. Qualitative defects • Count may be normal/low/high • May be no apparent abnormality on film • May show changes eg size, appearance etc • Functionality is variably affected • May be inherited or acquired