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PCR-RFLP 基因分型方法

PCR-RFLP 基因分型方法. --- 关于序列查找、引物设计和酶切位点分析. 尹继业. 概念. 聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析. 限制性片段长度多态性 ( restrition fragment length polymophism ， RFLP ): 是指由限制性酶切位点间的插入 ﹑ 缺失 ﹑ 重排或 点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。. PCR-RFLP:

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PCR-RFLP 基因分型方法

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Presentation Transcript

  1. PCR-RFLP 基因分型方法 ---关于序列查找、引物设计和酶切位点分析 尹继业

  2. 概念 聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析 限制性片段长度多态性(restritionfragmentlengthpolymophism，RFLP): 是指由限制性酶切位点间的插入﹑缺失﹑重排或 点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。 PCR-RFLP: 是在 PCR 和 DNA 序列分析基础上产生的 RFLP 技术。该方法是通过 PCR 扩增一段 DNA 片段，然后再选择适当的限制性内切酶，消化 PCR 产物，经电泳，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。

  3. 概念

  4. 概念 基 因 型 Step by step 电 泳 选择内切酶 设计引物 确定基因序列

  5. 基因序列查找 gDNA Promoter Exon 1 Exon 3 Exon 2 Promoter cDNA

  6. 基因序列查找 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank http://www.genomatix.de/ http://expasy.org/sprot/

  7. 基因序列查找 选择 gene 输入基因名称

  8. 基因序列查找 基因的全称 基因的物种来源

  9. 基因序列查找 cDNA序列 gDNA序列

  10. 基因序列查找 序列 如何详细区分每一个外显子和内含子？

  11. 基因序列查找

  12. 基因序列查找 全序列 外显子

  13. 基因序列查找 包含有该外显子的序列 该外显子的全序列

  14. 基因序列查找 起始密码子 外显子 启动子？ 内含子

  15. 启动子序列查找 先免费 注册

  16. 启动子序列查找 登录

  17. 启动子序列查找 选择Gene2Promoter

  18. 启动子序列查找 选择物种 基因的名字

  19. 启动子序列查找 提交

  20. 启动子序列查找 选择你的基因 继续

  21. 启动子序列查找 不同颜色代表该启动子序列的可靠性，金黄色代表实验研究证明 可以选择是否 分析该启动子

  22. 启动子序列查找 开始分析

  23. 启动子序列查找 继续提交

  24. 启动子序列查找 点击获 得序列

  25. 启动子序列查找 详细序列

  26. 如何确定我的SNP位置 C218A：外显子编码方式 C-256A：启动子编码方式 rs431898：pubmed SNPs数据库编号

  27. 如何确定我的SNP位置 C-256A ATG的A是第一位 C218A

  28. 如何确定我的SNP位置 输入编号 rs……. 选择SNP选项

  29. 如何确定我的SNP位置 该SNP附近的序列 关于该SNPs的详细信息

  30. 如何预知我的SNP的功能意义 输入蛋白的名称

  31. 如何预知我的SNP的功能意义

  32. 如何预知我的SNP的功能意义

  33. 如何预知我的SNP的功能意义 结构域 名称 起止氨基酸编号 该结构域的氨基酸长度

  34. 如何预知我的SNP的功能意义 氨基酸的改变 多态性 包括SNPs 是否有功能意义 定点诱变研究

  35. 基因序列查找 更多序列查找方法、查找途径、数据库信息和序列比对 请参考

  36. 引物设计 引物设计

  37. 引物一般原则 基本原则： 1. 引物要跟模板紧密结合， 2. 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在， 3. 引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。 需要考虑的因素： 引物长度（primer length）、 产物长度（product length）、 序列Tm值(melting temperature)、 ΔG值(internal stability)、 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin） 错误引发位点（false priming site）、 引物及产物GC 含量（composition）

  38. 引物一般原则 引物的长度：15-30bp，常用的是18-27bp 太短：特异性不好 太长：延伸温度大于Taq酶的最适温度 引物末端要求：3’端的序列要比5’端重要， 引物3’端的碱基一般不用A A在错误引发位点的引发效率相对比较高 ， 5’端序列对PCR 影响不大，常用来引进修饰位点或标物。 引物的GC含量 ：一般为40-60%，以45-55％为宜 两条引物之间的GC含量不宜相差太大

  39. 引物一般原则 Tm 值：尽量保证两条引物的Tm值相匹配。最 好相差不要大于5 度 引物二聚体及发夹结构的能量：绝对值一般不要超过4.5 最好不要位于3’末端 否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行 ，如果在5’末端对反应就没有多大的影响了 ΔG值: 反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的 ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高而 3’端ΔG值相对较低，且不要超过9。如此则有利于正确引 发反应而可防止错误引发

  40. PCR-RFLP 引物特殊要求 PCR产物的长度：200-1000bp 酶切后产物片断的大小差距：100bp以上

  41. 引物设计 工欲善其事，必先利其器 Primer Premier 5.0 引物设计 Oligo 6.0 引物评价

  42. 引物设计 新建窗口 输入序列

  43. Primer Premier 5.0 突变位点 选取突变位点前后约500bp长度的碱基

  44. Primer Premier 5.0 引物设计 酶切位点分析

  45. Primer Premier 5.0 自动搜索引物 手动编辑引物

  46. Primer Premier 5.0 前引物的位置（必须超过突变位点） 引物的长度 后引物的位置（必须在突变位点之后） PCR产物的长度

  47. Primer Premier 5.0 引物的综合评分，分越高引物越好 引物序列 引物的详细信息

  48. Primer Premier 5.0 交叉二聚体 发夹结构 二聚体 错配

  49. Primer Premier 5.0 更高级应用： 参数的设置 手动搜索或者修改引物 搜索特殊引物（比如单条引物的搜索等）

  50. Oligo 6.0 新建窗口 输入前引物

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