1 / 25

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 12 . AFLP

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 12 . AFLP. Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2011. Princip metody. AFLP - A mplified F ragment L ength P olymorphism Vos et al. 1995, Nucleic Acid Res. 23: 4407-4414 název má upomínat na RFLP

zizi
Download Presentation

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 12 . AFLP

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 12. AFLP Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2011

  2. Princip metody AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism • Vos et al. 1995, Nucleic Acid Res. 23: 4407-4414 • název má upomínat na RFLP • v podstatě trochu náhrada za některé varianty RFLP • restrikční metoda • restrikce celkové DNA organismu • vizualizace části fragmentů pomocí PCR • dominantní data (přítomnost / nepřítomnost fragmentu dané délky) • spolehlivá a opakovatelná metoda • velká specifita restrikčních enzymů, síla a spolehlivost PCR • hodně fragmentů • sleduje ± celý genom

  3. MseI EcoRI Princip metody 0) Analyzujeme celkovou DNA • vysoké požadavky na čistotu • relativně velké množsví (min. 50-100 ng,někt. protokoly i více) • netřeba další informace o genomu 1) Restikce genomické DNA • enzymy EcoRI a MseI („rare cutter“ a „frequent cutter“)

  4. Princip metody 2) Ligace adaptorů T4 ligase ATP Mueller & Wolfenbarger 1999, TREE

  5. Princip metody 3) Preselektivní amplifikace (PCR) • primery komplementární k adaptorům • +1 selektivní nukleotid • namnožena 1/16 proužků, které mají MseI / EcoRI místo selektivní nulkeotid Mueller & Wolfenbarger 1999, TREE

  6. Princip metody 4) Selektivní amplifikace • templát = ředěný produkt preamplif. • 3 selektivní nukleotidy (1/256 proužků z preamplifikace) • jeden z primerů (typicky EcoRI)fluorescenčně značený • primerové kombinace (složení selekt.nukleotidů) se „naslepo“ zkouší • dostatek fragmentů, jasně odlišené, ± podobná intenzita Mueller & Wolfenbarger 1999, TREE

  7. Princip metody 5) Přečištění produktu 6) Fragmentační analýza • denaturace formamidem • přidán velikostní standard • analýza v sekvenátoru • dříve na denaturačním PAA gelu • možnost smíchat až 4 barvy vzorku

  8. Princip metody • Teoreticky by mělo fungovat s jakýmikoliv 2 enzymy • „lepivé“ konce fragmentů • různá frekvence štěpení • v praxi pouze původní EcoRI + MseI • běžné = levné, vyzkoušená metodika • 3 třídy fragmentů • EcoRI + MseI • EcoRI + EcoRI • velmi vzácné • MseI + MseI • teoreticky nejhojnější • při značení EcoRI primeru neviditelné • vznikají překvapivě málo, lze použít i značení MseI primeru A – EcoRI*+MseI B – EcoRI + MseI* C – MseI* I,II,III,IV - různé primerové kombinace Vos et al. 1995

  9. Standardizace • stejná počáteční koncentrace DNA u všech vzorků • stejné reakční podmínky (jednotný protokol a zdroj chemikálií, stejný profil PCR, ideálně stejný cycler) • negativní kontroly (vyloučení kontamince) • vyhodnocení dat pokud možno jednou osobou • opakování cca 10% vzorků, výpočet error rate • error rate = počet rozdílů / (počet lokusů * počet vzorků) • vyloučení pozic a) kde byl rozdíl, b) vzácnějších než error rate • error rate by měla být malá, řádu jednotek % • viz Bonin et al. 2004, Mol. Ecol. 13: 3261–3273

  10. Vyhodnocení dat • Vznik variability • mutace v restrikčním místě (vznik/ zánik) • inserce/delece mezi restrikčními místy • Předpoklady • homologie stejně migrujících fragmentů • nebrat krátké fragemnty • rozmezí (50-)100-500 bp • nezávislost lokusů (fragmentů) • Skórovat jen jasné markery • rozumná intenzita píků, konzistentní mezi vzorky • jsem schopný se vždy rozhodnout, jestli pík je nebo není

  11. Vyhodnocení dat – metodické problémy • Technické • nestejná intenzita píků mezi vzorky / opakováním vzorku • drobné posuny v určení velikosti fragmentu • Neznámá genetická podstata proužků • nejistá homologie stejně dlouhých fragmentů • nejistá nezávislost lokusů (platí pro mutace v restrikčních místech, ale ne pro indely uvnitř framentů – kodominantní) • neznámá dědičnost (jádro × chloroplast mitochondrie) • Nespecifičnost postupu • fragmenty mohou vznikat i z jiné DNA – endofyti, epifyti, drobné kontaminace, … • takto mohou vznikat drobné rozdíly mezi identickými vzorky (např. různé ramety jednoho klonu)!

  12. Vyhodnocení dat • dominantní (binární) data = matice 0/1 • obvyklé postupy pro binární (dominantní) data • statistika lokusů (polymorfismus, privátní,…) • shlukové analýzy, PCoA, neigbour-networks, • popul. genetika (diverzita, AMOVA, odhady FST, kinship,…) • Baysian clustering (STRUCTURE, BAPS,…) • prostorová statistika, autokorelace,…

  13. Vyhodnocení dat DW-index (frequency-down-weighted marker values) • Schönswetter & Tribsch 2005, Taxon 54: 725–732 • teoreticky použitelný i na ISSR apod., v praxi hlavně AFLP nik počet výskytů fragmentu i v populaci k ni počet výskytů fragmentu i v celém datovém souboru • index měří míru izolovanosti (unikátnosti) populace • roste s výskytem vzácných fragmentů • vyšší hodnoty jsou očekávány v populacích • dlouhodobě izolovaných • refugiálních • pův. diverzita druhu, z níž jen část se rozšíří při expanzi areálu

  14. Výhody není nutná znalost genomu (univerzální metoda) velké množství lokusů (desítky až >100 na jednu primerovou kombinaci) zobrazuje variabilitu celého genomu (ale opravdu ?) spolehlivost, vysoká reprodukovatelnost AFLP - Srovnání s jinými metodami Nevýhody • vyšší nároky na množství a čistotu DNA • cena • komplikovaný postup • dominatní data • nejistá homologie fragmentů, neznámá dědičnost, … • optimalizace (vyhledávání primerových kombinací)

  15. Modifikace a podobné metody • S-SAP a jeho varianty • pro PCR amplifikace použit 1 AFLP primer a primer komplementární k nějaké sekvenci • Typicky transpozony, ale může být cokoliv jiného • nutná sekvenční informace → hlavně modelové druhy • SAMPL (selective amplification of microsatellite polymorphic loci) • jako AFLP, ale v selektivní amplifikace 1 AFLP primer nahrazen primerem komplementárním k složenému mikrosatelitu (CACACAGAGAGA) • primer ukotvený, nasedá přes „zlom“ v mikrosatelitní sekvenci • část variability je dána délkovou variabilitou mikrosatelitu

  16. Modifikace a podobné metody • Microsatellite-AFLP (MFLP) • restrikce jen MseI, amplifikace s MseI primerem a 5‘anchored jednoduchým mikrosatelitním primerem • variabilita je dána mikrosatelitem • obchází potřebu specifické sekvence pro mikrosatelity, ale zase je nutné hledat vhodné primerové kombinace • AFLP se speciálními restriktasami • např. studium metylace genomu • porovnání AFLP profilu restriktasy necitlivé k metylaci (např. MspI) a isoschisomeru (= jiný enzym rozeznávající stejnou sekvenci) citlivého k metylaci (např. HpaII) (+ EcoRI) • … a další finty v tomto duchu • AFLP se třemi restriktasami, atd.

  17. Použití AFLP • fylogeneze • jen u příbuzných taxonů (max. druhy v rámci rodu) • vnitrodruhová variabilita • taxonomie (vymezení blízce příbuzných druhů, poddruhů,…) • fylogeografie • populační biologie • chráněné a vzácné druhy; invaze • jemná genetická struktura, prostorové vztahy, kinship,… • klonální struktura • hybridizace • rozmnožovací systémy, parentage analysis

  18. Fylogeneze, taxonomie Bog et al. 2011, Planta 232: 609–619 • taxonomie rodu Lemna, morfologickytěžko neřešitelné • všech 13 uznávaných druhů • NJ strom, STRUCTURE • 10 druhů povrzeno (větve v NJ, shluky v STRUCTURE) • 2 druhy nepotvzeny (rozpadají sedo různých větví / shluků) • 1 druh (L. gibba) se rozpadá do 4skupin = typické klony + asi hybridis jinými druhy + 1 skupina nejistépozice

  19. Fylogeneze, taxonomie Španiel et al. 2011, Plant Syst. Evol. 294: 1–25 • taxonomie Alyssum montanum • tradičně 2 poddruhy (skály × písky) bez ohledu na ploidii + drobné endemity • PCoA + NJ identifikují hlavní skupinu +pár malých shluků; v rámci hlavní skupi-ny určitý rozdíl mezi 2x a 4x • rozdíly mezi stanovišti neexistují • podobné výsledky i STRUCTURE a AMOVA a morfometrika (!) • morfologické rozdíly mezi 2x a 4x malé • nerozlišovat jako samostatné taxony • taxonomii druhu bude nutno překopat PCoA vše PCoA skály × písky

  20. Fylogeografie Paun et al. 2008, Molec. Ecol. 17: 4263–4275 • Ranunculus alpestris agg. • Alpy, izolovaně Z Karpaty, J Karpaty • AFLP + cp DNA • genetická diverzita × DW-index: • diverzita = průměrná He přes lokusy www.slovenskevrchy.estranky.sk/ diverzita DW-index

  21. Fylogeografie Paun et al. 2008, Molec. Ecol. 17: 4263–4275 • AFLP: 3 hlavní skupiny (NJ, PCoA, Structure) • Z Alpy, V Alpy + Karpaty, J Alpy + zbylé 2 endemické druhy (skoro monofyletické) • cpDNA: 9 haplotypů, 2 hlavní skupiny: • R. alpestris + 1 populace R. bilobus • R. bilobus + R. traunfellneri a 2 pop. R. alpestris • nesoulad = hybridizace • chloroplast capture • více refugií, alopatrickáspeciace • karpatské populace – migrace z vých Alp.

  22. Hybridizace Oberprieler et al. 2011, Plant Syst. Evol. 293: 177–191 • Senecio ovatus × S. germanicus, čisté i směsné p. • AFLP + morfologie + sek. metabolity • AFLP, Structure: ve většině směsných populací izolované, ale 1× hybridní roj • silná korelace s morfologií i metobolity (matice vzdáleností, Mantel test) • v hybridním roji hlavně zpětní kříženci k S. germ,chybí F1 a F2 hybridi (Structure, NewHybrids) • kříží se vzácně, pakintrogrese do S. germ. BC-o BC-g ovatus germanicus F1,F2 www.floraweb.de

  23. Populační genetika Cires et al. 2011, Plant Syst. Evol. 297: 75–85 • Cochlearia pyrenaica (ochranářská genetika) • vzácný druh, větš. chráněný, Natura2000,… • 5 populací ze záp. Evropy • nízká variabilita v populacích (He, Hsh,počet polymorfních lokusů), diferenciacemezi populacemi (GST = 0.38) • AMOVA: 49% uvnitř. pop., 17% v regionu, 34% mezi regiony • doporučení pro ochranu • každá oblast unikátní, třeba chránit vcelém areálu • do různých záchranných kultivací, sbírky semen apod. zahrnout materiálz každé oblasti http://flora.nhm-wien.ac.at/

  24. Klonalita Pfeiffer et al. 2011, Plant Syst. Evol. 292: 189–201 • Gagea lutea (2n = 6x) a G. spathacea (2n = 9x) v Německu • oba druhy podzemní dceřiné cibule +u G. lutea v dospělosti jen semena,G. spathacea sterilní (lichá plodie) • G. lutea: clonal diversity 0.5–0.6; asi1/3 genet klonálních, zbytek jen 1výskyt; rozsah klonů až 28 m • G. spathacea: všechno 1klon (i různé lokality) • variabilita = somatickémutace (v jedné popul.asi ano) nebo endofyt, houba rodu Ustilago G. lutea G. spathacea www.pbase.com ↓ Podobnost mezi vzorky – definice klonů

  25. Prostorová struktura Jump et al. 2009, Plant Biol. 11: 152–160 • populace Fumana thymifolia na ploše 80 × 60 m (9 plošek, 114 jedinců celkem) • keřík, opylován hmyzem, cizosprašný,slabá autogamie (dělali pokus) • průkazná isolation by distance • podobnost (kinship coefficient) sousedů srovnatelná s hodnotoupro potomky 1 mateřské rostliny • velmi omezené šíření semen • detekovatelná průkazná podob-nost do 20 m vzdálenosti • efektivní šíření pylu de.wikipedia.org průměrný kinship coefficient pro danou vzdálenostní třídu 95% conf. int.

More Related