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SAPIENZA Università di Roma

SAPIENZA Università di Roma. Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Laurea Magistrale in Genetica e Biologia Molecolare AA 2013/2014 Biotipizzazione di isolati clinici di Klebsiella pneumoniae resistenti ai carbapenemi (ceppi KPC): genomica e proteomica a confronto .

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  1. SAPIENZA Università di Roma Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Laurea Magistrale in Genetica e Biologia Molecolare AA 2013/2014 • Biotipizzazione di isolati clinici di Klebsiella pneumoniae resistenti ai carbapenemi (ceppi KPC): genomica e • proteomica a confronto. • Relatore interno: Candidata: • Prof./Dott. Maria Egle De Stefano Marta Fioravanti • Relatore esterno: • Dott.ssa Silvia Angeletti

  2. Klebsiella pneumoniae Fig.1 - Enterobatteriaceae • Batterio Gram-negativo, appartenente alla famiglia delle Enterobatteriaceae. • È responsabile di gravi infezioni nosocomiali causate da • ceppi ESBL (extendedspectrumβ–lactamase) resistenti agli antibiotici β-lattamici • ceppi CR (carbapenemresistant) resistenti ai carbapenemi

  3. Klebsiella pneumoniae Le β–lattamasidegradano il lattame della maggior parte degli antibiotici -lattamici ma non sono in grado di legare gli antibiotici carbapenemi. Fig.2 - Penicillina Le carbapenemasi degradano l’anello β–lattamicodei carbapenemi, inattivando il potenziale antimicrobico del farmaco. Fig.3 - Carbapenema

  4. Diffusione globale K. pneumoniae CR(ceppi KPC) Singoli isolamenti di ceppi KPC Numerose manifestazioni di ceppi KPC Aree endemiche per ceppi KPC Nordmann P. and Poirel L. (2011). Global spread of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Emerg Infect Desease; 17: 1791-1799

  5. Diffusione dei ceppi KPC • Ceppi KPC prevalentemente isolati in Italia: • ST 258 • ST 512 Pantosti A., Pagani L., Luzzaro F. and Rossolini GM. (2013). Epidemic diffusion of KPC carbapenemase-producing Klebsiellapneumoniaein Italy: results of the first countrywide survey, 15 May to 30 June 2011. Euro Surveill. 18; 1-13.

  6. SCOPO DEL LAVORO Il lavoro nasce dall’esigenza di determinare le caratteristiche fenotipiche e genotipiche dei ceppi KPC circolanti all’interno di un singolo contesto ospedaliero, il Campus Bio-Medico di Roma. Si voleva confrontare queste caratteristiche con i dati derivanti dall’analisi degli spettri proteici dei ceppi effettuata con l’innovativa tecnica MALDI-Tof. Sulla base della somiglianza degli spettri proteici è possibile costruire un dendrogramma che permette di suddividere gli isolati in diversi gruppi. • Obiettivo dello studio è stato quello di determinare quale delle metodologie usate fosse utile nel follow-up epidemiologico di ceppi MDR (multidrug-resistant) in ambito ospedaliero.

  7. MATERIALI E METODI • 25 ceppi di K. pneumoniae KPC isolati da campioni clinici nel periodo da gennaio 2012 a febbraio 2013: • 10 da infezioni del tratto urinario; • 7 da infezioni di siti chirurgici; • 5 da emocolture; • 3 da infezioni del tratto respiratorio. Lo studio prevede il confronto di tre diverse metodiche: • MLST (Multilocus Sequence Typing) per la genotipizzazione dei ceppi; • HMRA (High Melt Relolution Analysis) per la caratterizzazione genomica; • MALDI-TofMS(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) per la caratterizzazione proteomica.

  8. MATERIALI E METODI Il lavoro è suddiviso in più parti: • semina del campione e isolamento delle colonie batteriche; • identificazione dei microrganismi isolati; • antibiogramma e dosaggio della MIC; • estrazione del DNA batterico; • MLST: sequenziamento del frammento amplificato e purificato; • HMRA: caratterizzazione genomica dei ceppi; • caratterizzazione geni cps e blaKPC ; • Maldi-TOF MS: caratterizzazione proteomica dei ceppiin base allospettro proteico.

  9. MATERIALI E METODI II quadrante I quadrante 1.semina del campione e isolamento delle colonie batteriche Questa fase del lavoro richiede le seguenti procedure: • raccolta dei campioni clinico, • semina dei campioni su piastre selettive con tecnica a“quattro quadranti”, • incubazione delle piastre a 37°C con 5% di O2 per 24-48 ore. III quadrante IV quadrante

  10. MATERIALI E METODI • 2. Identificazione degli isolati Fig.4 - MALDI - Tof MS

  11. MATERIALI E METODI • 2. Identificazione degli isolati La procedura prevede: • il trasferimento di una singola colonia microbica nel pozzetto della lastra metallica; • l’aggiunta di 1µL di acido • α-cyano-4 idrossicinnamicoin 50% di acetonitrile e 2.5% di acido trifluoroacetico su ogni pozzetto; • lasciare asciugare la matrice; • inserimento della lastra in un’apposita camera ionizzante dello strumento.

  12. MATERIALI E METODI • 3.Antibiogramma e dosaggio della MIC • ceppi S • ceppi ESBL • ceppi CR • ceppi MDR Antibiotici testati: Piperacillina Amoxicillina Ceftazidime Cefotaxime Cefepime Imipenem Meropenem

  13. MATERIALI E METODI • Estrazione del DNA batterico • MLST: sequenziamento del frammento amplificato e purificato L’analisi MLST prevede i seguenti passaggi: • scelta dei frammenti genici; • sequenziamento dei frammenti scelti; • analisi degli elettroferogrammi e dei profili allelici tramite programmadisponibile sul sitowww.pasteur.fr.

  14. MATERIALI E METODI • Estrazione del DNA batterico • MLST: sequenziamento del frammento amplificato e purificato Geni housekeeping: gapA 450 bpprimer F:gapA173 - R:gapA181 (gliceraildeide3fosfato deidrogenasi) infB 318 bpprimer F:infB1 - R:infB2 (fattore2 di inizio della trascrizione) Mdh 477 bpprimer F:mdh130 - R:mdh867 (malato deidrogenasi) Pgi 432 bpprimer F:pgi1R - R:pgi1F (fosfoglucosio isomerasi) phoE420 bpprimer F:phoE604.1 - R:phoE604.2 (fosforina E) rpoB501 bpprimer F: rpoBvic3 - R:rpoBvic2 (subunità β della RNA polimerasi) tonB414 bpprimer F: tonB1 - R:tonB2 (trasduttore periplasmatico) Diancourt L. et al. (2005). Multilocus sequence typing of Klebsiella pneumoniae nosocomial isolates. J. Clin. Microbiol.43; 4178-4181.

  15. MATERIALI E METODI • Estrazione del DNA batterico • MLST: sequenziamento del frammento amplificato e purificato • sequenziamento eseguito presso la PRIMM Biotech • utilizzando sequenziatori automatici ABI (AppliedBiosistems) • con tecnica del dye terminator. Profilo allelico di K. pneumoniae KPC ST512 Fig.5 - Elettroferogramma http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/kpneumoniae.html

  16. MATERIALI E METODI • 6. HMRA: caratterizzazione genomica dei ceppi Florescence (%) Questa tecnica si compone di due fasi: • amplificazione per PCR dei frammenti in presenza della molecola fluorescente EvaGreen, • acquisizione della fluorescenza emessa per incremento della temperatura. Temperature (°C) Florescence (%) Temperature (°C)

  17. MATERIALI E METODI • 7. Caratterizzazione dei geni cps e blaKPC • Il gene cps codifica per l’antigene della capsula. • ST258wzy-I- F e ST258wzy-I- R, primers specifici per la capsula di tipo I, • ST258wzy-II- FeST258wzy-II- R, primers specifici per la capsula di tipo II. Hopkins K, Pitout JD, Bonomo RA, Woodford N, DeLeo FR and Kreiswirth BN (2014). Multiplex PCR for identification of two capsular types in epidemic KPC-producing K. pneumoniae sequence type 258 strains.Antimicrob Agents Chemother. 58; 4196-4199. • Il gene blaKPC codifica per l’enzima carbapenemasiKPC. primer F:KPC-F-107 • primer R:KPC-R-860 • Rosenthal ME, Zhao Y,. Bonomo RA, Kreiswirth BN (2011). Multiplex Real-Time PCR Assay for Detection and Classification of Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Gene (blaKPC) Variants. Clin. Microbiol. 49(2): 579.

  18. MATERIALI E METODI • 8. Maldi-Tof MS: caratterizzazione proteomica dei ceppi in base allo spettro proteico • software FlexControl versione 3.4 (Bruker) • sistema Biotyper MSP • per la costruzione di un dendrogramma; • programma ClinProTools • per il clustering degli isolati.

  19. RISULTATI

  20. RISULTATI

  21. RISULTATI

  22. RISULTATI software BiotyperMSP (Bruker) identificazioni con score superiore a 2.0 I II Gruppo I,costituito da 14 isolati KPC; Gruppo II,costituito da 11 isolati KPC.

  23. RISULTATI Programma ClinProTools II I Il Cluster I è costituito dagli stessi 14 isolati KPC del gruppo I. Il Cluster II comprende gli 11 isolati KPC del gruppo II.

  24. RISULTATI

  25. RISULTATI Gentamicina (GN); cotrimossazzolo (SXT); fosfomicina (FOS); colistina (CS).

  26. CONCLUSIONI • La suddivisione temporale rispecchiata dal dendrogramma e confermata dal ClinPro Tools suggerisce che l’analisi proteomica sia in grado di mettere in evidenza anche cambiamenti che si verifichino in un arco temporale breve, rendendo la metodica estremamente sensibile nel raggruppare ceppi MDRed uno strumento utile per seguirne la diffusione epidemiologica in ambito ospedaliero. • Lo studio del gene blaKPC e l’antibiogramma ci ha permesso di escludere che gli isolati del cluster II ST512 fossero la manifestazione della circolazione di un unico clone all’interno dell’ospedale. • Questo lavoro ci permette di affermare che l’utilizzo combinato della metodica MALDI-Tof MS, MLST e del sequenziamento del gene blaKPC può rappresentare uno strumento promettente per l’analisi epidemiologica di ceppi MDR in ambito ospedaliero.

  27. Grazie per l’attenzione !

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