Bioinformatica

1. Bioinformatica Giulio Pavesi Dip. Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano giulio.pavesi@unimi.it

2. Il “dogma”, di nuovo Gene Trascritto Trascrizione+ Splicing Traduzione Proteina

3. Geni e sequenziamento Proteoma Trascrittoma Genoma

4. Geni e sequenziamento 5’ (m)RNA 3’ Predizione regione codificante e traduzione in proteina codificata STOP ATG Mappatura sul genoma 5’ 3’ Esone 1 Esone 2 Esone 3 5’ 3’ Gene sul filamento positivo ...oppure... STOP! ATG

5. Geni e sequenziamento 5’ (m)RNA 3’ Predizione regione codificante e traduzione in proteina codificata STOP ATG Mappatura sul genoma 5’ 3’ Esone 3 Esone 2 Esone 1 5’ 3’ Gene sul filamento negativo ATG STOP!

6. Quanti geni? • Osservando il risultato della mappatura dei trascritti sul genoma, è possibile “contare” in quanti geni si suddividono, nelle diverse specie: • E.coli (4,7 milioni pb) • 4300 “geni” • S.cerevisiae (12 milioni pb) • 6700 “geni” • D.melanogaster (169 milioni pb) • 13,900 “geni” • C.elegans (97 milioni pb) • 19,000 “geni” • Uomo (3,2 miliardi pb) • 23,000 “geni” • Topo (2,9 miliardi pb) • 23,000 “geni” • D.rerio (zebrafish, 1,5 miliardi pb) • 26,000 “geni” • A. thaliana (pianta, 120 milioni pb) • 30000 “geni” • Riso (488 milioni pb) • 57,000 geni

7. Quanti geni? • Si sapeva già prima del sequenziamento come la “quantità” di DNA non fosse proporzionale alla “complessità” dell’organismo • La sorpresa, all’epoca dei primo progetti genoma, fu che anche il “numero di geni” codificanti per proteine lo fosse • Il numero di geni umani, confrontato con quelle delle altre specie, si ridusse più di 10 volte rispetto alle stime iniziali (da 300.000 a 100.000 a poco più di 20.000)

8. Il “dogma”, di nuovo UN Gene UN Trascritto Trascrizione+ Splicing Traduzione UNA Proteina

9. Regole ed eccezioni • Nella visione tradizionale, il rapporto tra i diversi elementi è 1:1:1 • Quindi, dati x geni annotati, mi aspetterei che le proteine codificate siano x • ....sarà proprio vero che un gene  un trascritto, e di conseguenza una proteina? • Esistono eccezioni, note già da molti anni: gli splicing alternativi, un gene  più trascritti, derivati da splicing differenti dei trascritti primari • Ma quanto è comune lo splicing alternativo? • Mappiamo un trascrittoma sul rispettivo genoma, e vediamo cosa succede...

10. UN trascritto? • Iniziamo dall’inizio... la trascrizione di un gene, inizia sempre esattamente nella stessa posizione? • E, termina sempre nella stessa posizione?

11. Partendo dall’inizio… 3’ 5’ ..... L’inizio della trascrizione non è praticamente MAI univoco: si può spostare di poche paia di basi Normalmente, si annota quello che sembra essere il punto di inizio della trascrizione utilizzato più di frequente

12. Partendo dall’inizio… 3’ 5’ ..... ... ma si può spostare anche di centinaia o migliaia di paia di basi, con l’effetto di utilizzare un primo esone differente!

13. Regolazione della trascrizione 3’ 5’ ..... La regolazione dell’inizio della trascrizione è un fenomeno molto complesso, che è l’effetto dell’interazione di particolari fattori (i fattori di trascrizione) con il DNA nelle vicinanze (ma non solo) dell’inizio della trascrizione stessa (solitamente, a monte, nella regione detta promotore), La trascrizione è regolata a seconda del tipo di cellula, degli stimoli, della fase del ciclo cellulare, e così via. Usare inizi della trascrizione “alternativi” come quelli sopra implica regolazioni differenti in condizioni differenti: la trascrizione inizierà in punti diversi a seconda delle condizioni

14. Ritornando al dogma • .. seconda domanda: un gene, produce un’unica proteina? • … che effetto ha la variabilità dei trascritti sulla proteina codificata dal gene? • ... e se la proteina codificata fosse sempre e comunque una, a cosa servirebbero gli introni?

17. Introni.. GT-AG (o GC-AG): Spliceosoma U2-dipendente AT-AC: Spliceosoma U12-dipendente (0.1% degli introni umani) snRNA dello spliceosoma U2

18. Introni

19. Splicing alternativi • I “segnali” posti all’inizio e alla fine degli introni sono visti dalla cellula come “taglia qui” • E’ noto da tanto tempo che i segnali possono essere interpretati in modo “alternativo” • Come? • E, quanto è comune questa interpretazione “alternativa”?

20. 1) Gli introni “trattenuti” • Prima modalità: i segnali vengono ignorati del tutto, e un introne può anche non essere tagliato via! pre-mRNA Splicing “normale” mRNA maturo pre-mRNA Splicing “mancato” mRNA maturo

21. 2) Segnali “in competizione” • Seconda modalità: ci possono essere più segnali di splicing in corrispondenza della stessa giunzione esone/introne Segnale alternativo Segnale alternativo e quindi, utilizzando i segnali alternativi..

22. 2) Segnali “in competizione” • .... è possibile che gli esoni si allunghino (o si accorcino) questo trascritto, rispetto al suo alternativo, ha il primo esone più corto ..

23. 2) Segnali “in competizione” • .... è possibile che gli esoni si allunghino (o si accorcino) Segnale alternativo Segnale alternativo questo trascritto, rispetto al suo alternativo, ha il secondo esone più lungo ..

24. 3) Esoni “a cassetta” • Terza modalità: un singolo esone può essere incluso, oppure no, nel trascritto maturo Taglia Taglia Taglia Taglia

25. 3) Esoni “a cassetta” • Terza modalità: un singolo esone può essere incluso, oppure no, nel trascritto maturo “Exon Skipping” un esone viene “saltato” e non incluso nel trascritto maturo Taglia Taglia

26. 4) Esoni mutualmente esclusivi • Quarta modalità: due esoni si possono escludere a vicenda. O si usa il primo O si usa il secondo

27. ... riassumendo...