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TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE : DE LA FISH AUX PUCES A ADN

TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE : DE LA FISH AUX PUCES A ADN. KARINE CORDIER-COUREL XXème colloque ATC Aix-en-Provence - 2010. Prolonger votre offre de soins, jour après jour. LA CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE. Cytogénétique conventionnelle. Cytogénétique moléculaire.

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TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE : DE LA FISH AUX PUCES A ADN

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  1. TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE : DE LA FISH AUX PUCES A ADN KARINE CORDIER-COUREL XXème colloque ATC Aix-en-Provence - 2010 Prolonger votre offre de soins, jour après jour

  2. LA CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE Cytogénétique conventionnelle Cytogénétique moléculaire Biologie moléculaire

  3. DE LA FISH AUX PUCES A ADN • FISH (Hybridation In Situ en Fluorescence) • Principe • Différents types de sondes • Applications • Avantages et inconvénients • CGH (Hybridation Génomique Comparative) • Principe • Sensibilité • FISH et CGH : Limites des techniques • Puces à ADN • Définitions • Différents types de puces • CGH-array • Puces à SNP • Intérêts, applications, inconvénients

  4. FISH : Principe FISH = Fluorescence In Situ Hybridization • Hybridation de séquences spécifiques marquées sur un génome entier : centromères, régions sub-télomériques, loci spécifiques et peintures • Détection de délétions, identification de translocations ou d’autres réarrangements chromosomiques

  5. FISH : Principe SONDE CIBLE ADN double brin marqué ADN double brin (mitoses ou noyaux interphasiques) Dénaturation thermique T A A G G A T A A T T C C T A T Hybridation complémentaire 37°C O/N

  6. FISH : Principe Elimination des sondes non spécifiquement fixées Lavages La sonde moléculaire se fixe sur sa cible Pas de sonde fixée = délétion Analyse au microscope en épifluorescence (filtres adaptés aux différents fluorochromes)

  7. FISH : Différents types de sondes Peintures chromosomiques Sondes centromériques M-FISH

  8. FISH : Différents types de sondes Loci spécifiques (Tuple1 / N85A3) Sondes télomériques RP11-335E8 2p12 RP11-356H17 2p13.3 Sondes de BACs

  9. FISH : Sondes de BAC • BacterialArtificialChromosome = ADN circulaire bactérien • dans lequel un fragment d’ADN (du génome humain) a été inséré • Sonde de BAC = sonde fabriquée à partir d’une • séquence d’ ADN connue insérée dans un vecteur de clonage • bactérien

  10. FISH : Choix des BACs • Sélection des BACs selon leur localisation chromosomique (en • fonction du réarrangement à étudier) ou la séquence d’un gène • d’intérêt • Séquençage du génome humain • =>Cartographie des chromosomes • => bases de données

  11. National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=9606 University of California Santa Cruz http://genome.cse.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway EnsemblGenome Browser http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html FISH : Choix des BACs

  12. FISH : Choix des BACs NCBI

  13. FISH : Choix des BACs NCBI

  14. Extraction de l’ADN bactérien Marquage par nick-translation (DNaseI, ADN pol, dNTP, dUTP*) Technique « lourde » 6 à 8 jours Culture bactérienne BAC Sonde prête à l’emploi pour la FISH Extraction et fragmentation de l’ADN bactérien Marquage par nick-translation (DNaseI, ADN pol, dNTP, dUTP*) Technique rapide 3 à 5 jours Amplification par PCR (dNTP, amorces, ADN pol) FISH : Fabrication de sondes de BAC cot 1, AcNa, EtOH

  15. FISH : Applications • Confirmation d’anomalies suspectées par le caryotype • Précision de points de cassure • Origine des marqueurs, dm, hsr • Détection des aneuploïdies • Détermination du sexe • Microdélétions • Suivi de traitements, recherche de maladie résiduelle • Suivi d’allogreffe (avec sexe opposé) de moelle

  16. FISH : Avantages et Inconvénients Avantages • Technique sensible (noyaux et métaphases) • Grand choix de sondes (commerciales ou « maison ») • Inconvénients • Technique lourde nécessitant des traitements différents selon la nature de l’échantillon à analyser (métaphases, noyaux, tissus) • Analyse ciblée : Nécessité d’avoir une idée préalable de la région chromosomique ou du gène à étudier • 3 cibles maximum par test

  17. CGH : Principe ADN de référence ADN à tester Co-hybridation nb copies ADN de référence>nb copies ADN test => délétion nb copies ADN test>nb copies ADN de référence => amplification

  18. FISH et CGH : Limites des techniques Caryotype CGH Analyse globale du génome Résolution = 5-10 Mb FISH Etude ciblée Résolution = 100-300Kb • Comment réaliser une analyse globale du génome et augmenter la résolution? • Hybrider de nombreuses sondes sur un échantillon? • Hybrider un échantillon sur de nombreuses sondes?

  19. PUCES A ADN : Définitions • Petites surfaces solides sur lesquelles un grand nombre de sondes ont été fixées • Puces à ADN = DNA arrays, DNA chips, DNA micro-arrays ou micro-arrays • BAC-array = sondes de BACs • DNA-array = faible densité (quelques centaines à quelques milliers de sondes) • DNA micro-array = haute densité (plusieurs milliers de sondes) • puces « pangénomiques » = ensemble du génome • puces « à façon » = ciblant une fonction biologique ou une pathologie

  20. PUCES A ADN : Différents types de puces Il existe trois types de technologies : • CGH-array proprement dite ( hybridation génomique comparative par rapport à un ADN de référence) • Bac-array (Array 300 Abbott, Cyto Chip Blue Gnome, …) : résolution limitée (50-200Kb) • Puces à oligo(Agilent) : meilleure résolution (oligonucléotides de 60-mer) • Puces à SNP  ne nécessitant pas d’ADN de référence ( Illumina, Affymetrix) : haute résolution (oligonucléotides de 25 à 80-mer) + recherche de régions de perte d’hétérozygotie

  21. PUCES A ADN : Etapes techniques • Extraction de l’ADN => quantification (A260nm) => pureté (A260nm / A280nm) => intégrité (migration sur gel d’agarose) • Digestion par des enzymes de restriction / Amplification par PCR • Marquage et Fragmentation • Hybridation • Lavages • Quantification du signal d’hybridation pour chaque sonde (lecture par un scanner) • Numérisation par un logiciel spécifique

  22. CGH-array : Principe • Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN (ou ARN/ARN) • Co-Hybridation compétitive de séquences d’ADN (ou ARN) test et témoin marqués par fluorescence sur un grand nombre de loci spécifiques présents sur un support solide (lame de verre) • Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau de loci spécifiques et connus sur un génome entier

  23. Loci spécifiques(BAC / PAC / oligonucléotides de synthèse) ADN test marqué en CYA3 Dénaturation et hybridation sur puce à ADN Lame de verre SCANNER ADN de référence marqué en CYA5 Défaut d’ADN test Excès d’ADN test CGH-array : Principe

  24. Ex : BAC-array / Array-300 Abbott® DAPI IV (sondes) Cy3 (ADN Test) Cy5 (ADN Référence) 3 spots / clone • 0.8 < T/R < 1.2 => pas de déséquilibre • T/R < 0,8 => délétion • T/R > 1,2 => amplification ratio T/R calculé CGH-array : Capture et Analyse des résultats

  25. CGH-array: Exemple d’application • Dysmorphie faciale => caryotype t(5;9) + dup(9)(q?)

  26. Peinture du chromosome 5 CGH-array: Exemple d’application • Confirmation par FISH (peintures des chromosomes 5 et 9) Peinture du chromosome 9

  27. CGH-array: Exemple d’application • Résultats analyse sur puce Array-300 Abbott®

  28. CGH-array: Exemple d’application • Résultats analyse sur puce IntegraGen®

  29. Puces à SNP: Principe • Les oligonucléotides spécifiques sont synthétisés directement sur la puce • Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN (ou ARN/ARN) • L’ADN à tester s’hybride avec sa séquence complémentaire fixée sur la puce • Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau des marqueurs spécifiques et connus sur un génome entier • Identification de pertes d’hétérozygotie (LOH)

  30. Puces à SNP: Analyse des résultats • Puce SNP6.0 / Affymetrix ®

  31. Puces à SNP: Analyse des résultats

  32. Puces à SNP: Analyse des résultats

  33. Puces à SNP: Analyse des résultats • Puce SNP6.0 / Genotyping Console / Affymetrix ®

  34. Puces à SNP: Analyse des résultats Allèle Différence Log2Ratio Copy Number state Segments Fishclones (BACs) Genomicvariants (polymorphismes) Refseq (gènes) Idéogramme / règle

  35. Puces à SNP: Analyse des résultats FISH CLONES (BAC)

  36. Puces à SNP: Analyse des résultats Refseq (gènes)

  37. Puces à SNP: Analyse des résultats GenomicVariants

  38. Puces à SNP: Analyse des résultats

  39. Puces à SNP : Résolution

  40. Puces à ADN : Intérêts • Pas de mise en culture des cellules à analyser • Analyse l’ADN de tout type de tissus • Technique hautement résolutive (< 150 Kb) • Analyse pangénomiquequi ne nécessite pas d’avoir une idée préalable de chromosomes impliqués (# FISH)

  41. Puces à ADN : Applications • Corrélations nombre de copies / conséquences biologiques • Compréhension de maladies (Couplée à une puce à ARN ) • Comparaison tumeur/tissu sain • Etude du génome des patients atteints d’une même pathologie et compréhension des mécanismes géniques

  42. Puces à ADN : Inconvénients • Anomalies chromosomiques équilibrées non détectables • Polymorphismes (encore beaucoup d’interrogations à ce sujet) • Seuil de sensibilité, mosaïques faibles? • Plateau technique onéreux

  43. CONCLUSION

  44. Remerciements • Département Génétique du Laboratoire • Equipe de R&D: AzarnoucheArdalan, Anne Bazin, Catherine Destigny, Hossein Mossafa • Françoise Allamy et son équipe de FISH • Sophie Pedronno et son équipe de Biologie moléculaire

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