Biotecnologie vegetali per l’industria e l’ambiente Biochimica classica - atto I

1. Biotecnologie vegetali per l’industria e l’ambienteBiochimica classica - atto I Il Cavallo RossoE. Corti (Ed. ARES)

2. Come manipolare il metabolismo? È necessaria la comprensione del sistema metabolico e di come venga modulato il flusso Metà corso dedicato alla comprensione dei sistemi multienzimatici Metà corso a discutere degli interventi di ingegneria metabolica

3. Il metabolismo: questo sconosciuto Un centinaio di anni di studio degli enzimi e dei metaboliti ci ha permesso di costruire accurate mappe metaboliche: E. Buchner: cell-free fermentation "Alcoholic Fermentation Without Yeast Cells". (1897) Ber. Dt. Chem. Ges.30: 117–124. http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1907/buchner-lecture.pdf

4. enzimologia vie metaboliche E’ possibile descrivere il metabolismo a partire dalle proprietà (studiate di solito in vitro) dei suoi componenti? Flux is phenotype! (H. Kacser) Teoria generale capace di predire i flussi?

5. Breve ripasso di enzimologia Colmate le lacune con attenzione (ad es. Voet & Voet, Biochemistry) Cinetica di MM irreversibile E + S = ES  E + P Derivazione della formula reperibile su tutti i testi (decenti) di biochimica. Formula e curva sono la stessa cosa detta in due modi diversi!!!

6. Curva v/S Significato di KM e Vm; unità di misura

7. Molte rappresentazioni della cinetica sono sballate Quando v raggiunge Vmax? A [S] infinito, cioè mai! http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/asympt.htm

8. y = 0 x = 0 Linearizzazione Esistono tipi diversi di linearizzazione (vedi Voet e Voet o Fell)

9. Inibizione competitiva E + S = ES  E + P + I  Ki es. Succinato deidrogenasi: fumarato (S) e malonato (I) EI + S = EIS  no reaction Il valore di Km viene aumentato: KMapp = KM(1+I/Ki)= KMα L’inibizione si annulla aumentando la concentrazione del substrato Che faccià avrà la linearizzazione in presenza di inibitore?

11. Inibizione incompetitiva E + S = ES  E + P + I  Ki es. EPSP sintasi (con glifosate) EIS  no reaction Il valore di Vm viene diminuito: Vmapp= Vm/(1+I/Ki)= Vm/α’ L’inibizione, inefficace a basse [S], non si annulla ad alte [S] Che faccià avrà la linearizzazione in presenza di inibitore?

12. Fosfoenolpiruvato (PEP) EPSP sintasi C H 2 3-enolpiruvil-3-shikimato -fostato (EPSP) Shikimato-3-fosfato - -2 O3P O COO Glifosate - - COO COO C H 2 - -2 -2 O PO O H O PO O COO 3 3 O H O H - 2- OOC N H PO 3 Reazione della EPSP sintasi e sua inibizione da parte del glifosate Nonostante assomigli molto a parte dello shikimato, il glifosate è un inibitore competitivo del PEP. La reazione è sequenziale, con lo shikimato che entra per primo, per cui il glifosate risulta essere un inibitore incompetitivo di questo primo substrato. Questo causa l’accumulo di Shikimato e la riduzione in Arogenato (che è un inibitore della DHAP sintasi che quindi esacerba l’accumulo di Shikimato) (vedi note) http://plantandsoil.unl.edu/Image/siteImages/ShikimatePathway.gif

13. + I  + I  Ki K’i EIS  no reaction EI Inibizione mista E + S = ES  E + P Sia Vm che Km cambiano: Vmapp = Vm/α′ e KM′ = α KM/α′ L’inibizione si sente sia a bassa che ad alta concentrazione di S Che faccia avrà la linearizzazione in presenza di inibitore?

14. Le inibizioni dal punto di vista grafico

15. Equazione MM reversibile Per una dimostrazione elegante: http://www.bioinformaticsservices.com/bis/resources/cybertext/chapter6.html

16. Due conseguenze importanti: La v della reazione reversibile sarà minore di quella irreversibile per due motivi: La presenza di prodotto rende più piccolo il numeratore La presenza di prodotto rende più grande il denominatore

17. La relazione di Haldane All’equilibrio v = 0 per cui il numeratore sarà = 0 = Keq

18. Le costanti cinetiche non sono indipendenti! Ricordatevi che il valore della Keq è indipendente dalla presenza dell’enzima Una formulazione alternativa dell’equazione si ottiene sfruttando la relazione di Haldane (sostituisco Vr)

19. (cioè una reazione molto spostata verso i prodotti) Quando la Keq >>1(o meglio P/Keq<< S) )A L’effetto di P si fa sentire solo sul denominatore (si parla di inibizione da prodotto)

20. Inoltre se [P]/KP è bassa ( 0 o comunque <<1) Che altro non è se non l’equazione per la reazione irreveversibile

21. Importantissimo L’equazione di MM irreversibile non descrive il comportamento in vivo perché la maggior parte degli enzimi catalizzano reazioni reversibili. Quella reversibile è cruciale per descrivere i sistemi reali Inoltre la maggior parte delle reazioni enzimatiche hanno più di un substrato o di un prodotto per cui si richiedono equazioni più complesse.

22. Sequenziali Enzimi a più substrati/prodotti A + B  C + D Equaz. generale (irrev.) Classificati secondo il meccanismo: *Random order * Compulsory order * Ping Pong

23. http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/transkinetics/ATCasekin.jpghttp://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/transkinetics/ATCasekin.jpg Enzimi allosterici: Molti enzimi non hanno curve iperboliche, ma sigmoidi, per cui sono stati introdotte teorie per spiegare questi comportamente (Hill, MWC e Koshland) v =Vm*(x*(1+x)n-1+L*c*x*(1+c*x)n-1)/((1+x)n+ L*(1+c*x)n) [MWC model] Andate a rivederli sul testo di biochimica !

24. atto II(ovverosia la termodinamica) Dopo le nozioni essenziali di enzimologia, ripassiamo alcuni concetti di termodinamica che sono rilevanti per le vie metaboliche

25. Si raggiunge sempre uno stato stazionario (ss)? Che conseguenze avrebbe non raggiungere uno ss… La presenza di un flusso in una via metabolica cosa implica dal punto di vista termodinamico? Un G ≠ 0 (<0) G = G°' + RT lnQ Q= quoziente di reaz. All’eq. G= 0 e G°' = –RT lnKeq G°' = –RT lnKeq = –2.3RT Log10(Keq) G°' è la variazione di energia libera in condizioni standard

26. Ordine di grandezza Da Lehninger ATP + H2O  ADP + Pi Go' = -31 kJoules/mol Pi + glucose  glucose-6-P + H2O Go' = +14 kJoules/mol

27. Values of Go and Keq for common reactions at 25oC Reaction Go(KJ/mol) Keq R = 8.314472[15] J · K-1 · mol-1 Go(kJ/mol)

28. Quoziente di reazione e Keq

29. ρ G = G°' + RT lnQ = –RT lnKeq+ RT lnQ = = RT ln(Q/Keq) = RT ln ρ (con ρ Disequilibrium ratio) Che valori assume ρ? Ovviamente tra 0 e 1 per G <0 Quanto più ρ è vicino a 0 tanto più G <0 (reaz. spontanea) ρ (o G, che concettualmente è la stessa cosa) è consideratoda molti un indicatore del potenziale di regolazione della reazione: *se ρ è molto piccolo (0) si ritiene che l’enzima sia un potenziale sito di regolazione (se ρ 1 c’è poca possibilità di regolazione)

30.  (=Q/Keq) e quindi G variano da tessuto a tessuto http://users.humboldt.edu/rpaselk/C431.F08/C431Notes/C431nLec31.htm

31. ΔG°' e ΔG in vivo nella glicolisi

33. Perché ρ è considerato un indice di potenziale regolazione? I metaboliti devono essere a concentrazioni nel range μM- mM A) Non possono essere a concentrazioni molto alte (es. 1M) * perché ci sarebbero effetti osmotici pesanti * perché le variazioni nel metabolismo sarebbero lente (ci sarebbe molto intermedio da smaltire) * perché si investirebbe molto in intermedi (e non prodotti)

34. B) Non possono essere a concentrazioni molto basse (es. nM) * perché gli enzimi avrebbero Km basse e quindi una bassa efficacia catalitica: Kcat / Km vale al max 108-109 * perché gli intermedi verrebbero esauriti velocemente (non ci sarebbero riserve efficaci di metaboliti) kcat is called the turnover number kcat = moli di substrato trasformato / mole di enzima/secondo Kcat = Vmax/Etot = turnover number n. di reazioni catalizzate da ogni sito attivo ogni secondo; per un enzima MMvale K2. Non può essere maggiore della frequenza con cui substrato ed enzima si incontrano. Se ogni incontro è produttivo, si avrà la perfezione catalitica http://www.aw-bc.com/mathews/ch11/c11kkkk.htm

35. Quando [S] << KM (soluzioni diluite) ricaviamo Pendenza della retta: kcat/KM ammettendo E= Etot : = (k2/KM)[E][S] ~ (kcat/KM)[E][S] Rate constant per reaz. Bimolecolare  Non può essere maggiore della velocità d’incontro

36. (kcat/KM) vale al massimo 108-109 cioè il valore massimo compatibile con la diffusione Diffusion theory predicts that kcat/KM will attain a value of about 108-109 (mol/L)-1s-1. Carbonic anhydrase, Catalase, Fumarase and Triose phosphate isomerase actually approach this limit. TIM accelerates isomerization by a factor of 1010 compared with the rate obtained with a simple base catalyst such as acetate ion. Indeed, the kcat/KM ratio for isomerization of glyceraldehyde 3-phosphate is 2 × 108 M-1 s-1.

37. Da Lehninger The kcatand activation energy of Rubisco from a variety of C3 and C4 plants Sage et al.

38. G <<0 G  0 Se questi 2 ragionamenti sono veri, ne consegue che : * quando G°' <<0 la reazione deve rimanere lontana dell’eq. * quando G°' 0 (Keq 1) la reazione deve rimanere vicina all’eq. Cosa significa (approssimativamente)? Cosa succederebbe infatti se le reazioni con G°' <<0 andassero all’equilibrio?

39. [P] >> [S] Con due reazioni di questo tipo in fila (come ad es. nella glicolisi GG6PF6PF1,6BP*), allora: [S] << [P1]  [P2] << [P3] e più precisamente: ([F1,6BP][ADP]2 / [G][ATP]2) = 106 E cosa succederebbe se le reazioni con G°' 0 fossero lontane dall’equilibrio… [P] << [S]

40. Riassumendo: Le concentrazioni dei metaboliti possono rimanere dentro ambiti sensati (μM-mM) se le reazioni con * G°' <<0 rimangono lontane dall’equilibrio (G <<0, vale a dire ρ0). Tali reazioni quindi devono essere ben regolate! * G°' 0 rimangono vicine all’equilibrio (G  0) Queste reazioni devono essere catalizzate da enzimi in eccesso (altrimenti rallentando rimarrebbero lontane dall’equilibrio)

41. Da Lehninger TPI aumenta la velocità della reazione 109 volte!!

42. Referenze Per la cinetica enzimatica vedere * Testo di biochimica (ad es. Voet and Voet, Biochemistry) * Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 3 Per la parte di cinetica chimica vedere: * Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 1.4.2 e 1.4.3

43. Effect of reversible inhibitors on the reaction rate: � no inhib. a)� mixed inhib. ([I] = Ki = 0.5 Ki'); lower Vmaxapp (= 0.67 Vmax), higher Kmapp (= 2 Km). b)� competitive inhib. ([I] = Ki); Vmaxapp unchanged (= Vmax), higher Kmapp (= 2 Km). c)� uncompetitive inhib. ([I] = Ki'); lower Vmaxapp (= 0.5 Vmax) and Kmapp (= 0.5 Km). d)� noncompetitive inhib. ([I] = Ki = Ki'); lower Vmaxapp (= 0.5 Vmax), unchanged Kmapp (= Km).

44. A special case of uncompetitive inhibition is substrate inhibition which occurs at high substrate concentrations in about 20% of all known enzymes (e.g. invertase is inhibited by sucrose). It is primarily caused by more than one substrate molecule binding to an active site meant for just one, often by different parts of the substrate molecules binding to different subsites within the substrate binding site. If the resultant complex is inactive this type of inhibition causes a reduction in the rate of reaction, at high substrate concentrations. It may be modelled by the following scheme: http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/inhibition.html

45. Effect of substrate inhibition the reaction rate. A comparison is made between the inhibition caused by increasing KS relative to Km. � no inhibition, KS/Km >> 100; � KS/Km = 100; � KS/Km = 10; � KS/Km = 1. By the nature of the binding causing this inhibition, it is unlikely that KS/Km < 1.

46. Competitiva

47. Incompetitiva

48. Mista Quando α = α‘ si parla di in. non-competitiva (la Km non cambia)

49. Effetto degli inibitori sui parametri cinetici