EXPRESSION DES GENES HOX DANS L'ALVEOLISATION

1. Mémoire présenté par Amine GHOZLANE EXPRESSION DES GENES HOX DANS L'ALVEOLISATION Responsable de stage : Jacques BOURBON, Directeur de recherche Equipe « Pathologie des épithéliums respiratoires et du développement pulmonaire » Stage réalisé dans le Laboratoire INSERM Unité 651, Faculté de Médecine : 8, Rue du Général Sarrail, 94010 Créteil Cedex

2. Alvéolisation Introduction • Alvéolisation : • Dernière phase du développement pulmonaire • Aboutit à la formation d’un poumon mature et complètement fonctionnel Humain 36 semaines 2 ans Naissance Alvéolisation Rat 4 jours 14 jours Anténatal Postnatal

3. Modifications structurales dans les régions distales du poumon pendant l’alvéolisation Après l’alvéolisation : Avant l’alvéolisation (stade sacculaire) : • Peu de gènes impliqués identifiés • Analyse systématique des gènes modulés pendant l’alvéolisation (Puces à ADN) • Canal alvéolaire • Septa secondaire • Alvéole 4. Pneumocyte de type I 5. Pneumocyte de type II 6. Capillaire • Canal alvéolaire • Septa primaire • Sacs alvéolaires 4. Pneumocyte de type I 5. Pneumocyte de type II 6. Capillaire source : http://www.snv.jussieu.fr/bmediahomeotiqueindex.html

4. Midkine (Mdk) Homeobox A2 (Hoxa2) Drosophila polarity gene (frizzled) homologue (Fzd1) Eph receptor B2 (Ephb2) Retinol-binding protein (Rbp1) Retinoid X receptor gamma (Rxrg) Integrin, alpha 1 (Itga1) Hoxa2 Drebrin 1 (Dbn1) Hoxa4 Shab-related delayed-rectifier K+ channel (Kv9.3) Homeobox A4 (Hoxa4) Hoxa5 Fibulin 5 (Fbln5) Mesenchyme homeobox 2 (Meox2) Timeless (Drosophila) homolog (Timeless) Latent transforming growth factor beta binding protein 2 (Ltbp2) Naissance Fibroblast growth factor receptor 3 (Fgfr3) Homeobox A5 (Hoxa5) Alvéolisation Platelet-derived growth factor receptor alpha (Pdgfra) Fibrillin-1 (Fbn1) Fibrillin-2 (Fbn2) Lysyl_oxidase_(Lox) 4 jours 14 jours Rat Fibronectin 1 Chondroitin sulfate proteoglycan 2 (versican) Agrin Glypican 3 (Gpc3) Fibroblast growth factor 10 (Fgf10) Slit (Drosophila) homolog 3 (Slit3) Endothelial differentiation sphingolipid G-protein-coupled receptor 1 Pleiotrophin (Ptn) 0 0.5 1 2 3 4 >5 Données des puces ADN Affymetrix : Gènes dont l’expression est fortement augmentée pendant l’alvéolisation 7 J/ 2 J 21 J/ 7 J Gènes Fold-change ratio

5. Les gènes Hox : • facteurs de transcription à homéodomaine • impliqués dans l’organogenèse • inactivation Hoxa5 = défaut d’alvéolisation (Kinkead et al. 2004) • pas d’autres données sur les Hox dans l’alvéolisation • Implication des gènes Hox dans les mécanismes de contrôle de l’alvéolisation ?

6. Hoxa2 * * 400 350 300 250 200 150 100 50 0 2 jpp 7 jpp 21 jpp Hoxa4 * * 400 350 300 250 200 150 100 50 0 2 jpp 7 jpp 21 jpp * * Hoxa5 350 300 250 200 150 100 50 0 2 jpp 7 jpp 21 jpp Confirmation des variations de l’expression des gènes Hoxa2, Hoxa4 et Hoxa5 par une méthode plus précise : la PCR en temps réel Les gènes Hox sont effectivement plus exprimés pendant l’alvéolisation dans les fibroblastes. Les variations sont-elles spécifiques de la période de l’alvéolisation ?

7. 300 250 Hoxa2 Hoxa4 200 Hoxa5 150 100 50 0 F18 F19 F21 J1 J3 J5 J8 J14 J20 Adulte Alvéolisation naissance Profil temporel d’expression des gènes Hoxa2, Hoxa4, Hoxa5 dans le poumon de rat depuis la période fœtale (stade canaliculaire) jusqu’à l’âge adulte (% de F18) jours Augmentation de l’expression des gènes Hox dans le poumon entier seulement pendant l’alvéolisation. Y a-t-il modification de l’expression de ces gènes lors de l’altération du développement alvéolaire ?

8. 100 µm 100 µm Air (FiO2 = 21%) Hyperoxie (FiO2 = 95%) Dexamethasone (0,1µg/g/j pendant 5 jours). Témoin Diluent Dex 0.1 µg/g/j Modèles expérimentaux d’altération du développement alvéolaire • Hyperoxie : FiO2 à 95% • Administration d’un glucocorticoïde :

9. Hoxa4 Hoxa2 140 * * * 140 120 NS 120 100 100 80 60 80 40 60 20 40 0 20 air O2 air O2 0 Hoxa5 air O2 air O2 * 4jpp 7jpp 4jpp 7jpp 4jpp 7jpp 120 * 100 80 60 40 20 0 air O2 air O2 Effets de l’exposition du rat nouveau-né à l’hyperoxie (FiO2>95%) sur l’expression des gènes Hoxa2, Hoxa4 et Hoxa5. Diminution de l’expression des gènes Hox dans le poumon entier sous hyperoxie.

10. Hoxa4 120 120 * 100 100 80 80 60 60 Hoxa5 Hoxa2 * * * 40 40 120 * * Témoin Dex Dex 100 20 20 0,1µg/g/j 0,5µg/g/j 80 0 0 60 40 20 0 Témoin Dex Dex Témoin Dex Dex 0,1µg/g/j 0,5µg/g/j 0,1µg/g/j 0,5µg/g/j Effets de l’administration répétée de dexamethasone (dex) 0,1µg/g ou 0,5µg/g par jour sur l’expression des gènes Hoxa2, Hoxa4 et Hoxa5 chez le rat nouveau-né. Diminution de l’expression des Hox dans le poumon entier après administration de dexamethasone.

11. Hoxa4 Hoxa5 140 140 120 120 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 Témoin dex10-6 M Témoin dex 10-6 M Effets in vitro de la dex sur l’expression des gènes Hoxa4 et Hoxa5 dans des fibroblastes isolés du poumon de rats nouveau-nés. Pas d’effet de la dexamethasone sur l’expression des gènes Hoxa4 et Hoxa5 dans les fibroblastes en culture.

12. Conclusion • L’expression des 3 gènes Hox : • est augmentée pendant l’alvéolisation • est diminuée lors de l’altération de l’alvéolisation • suit un profil identique • Ces résultats sont en faveur d’un rôle positif de ces gènes dans le mécanisme de contrôle de l’alvéolisation

13. Bilan du stage • Techniques pratiquées: • Isolement et culture primaire de fibroblastes • Extraction des ARN • RT- PCR temps réel • Aborder et exposer une problématique scientifique • Implication physiopathologique