Co je to molekulární taxonomie Zvláštnosti molekulárních znaků

1. MOLEKULÁRNÍ TAXONOMIE Náplň kurzu • Co je to molekulární taxonomie • Zvláštnosti molekulárních znaků • Metody získávání experimentálních dat • Metody zpracovávání dat • Biologická interpretace • Vaše dotazy a moje odpovědi

2. MOLEKULÁRNÍ TAXONOMIE Rozpis přednášek (9:50-11:20) • 21. 2. - Zahájení kurzu, taxonomie a molekulárně biologické znaky, metody sekvenace DNA • 27. 2. (16:30) - Alignment sekvencí + Databáze sekvencí a vyhledávání v nich (Marián Novotný) • 7. 3. - Získávání nesekvenčních molekulárních dat - multilokusové metody (RAPD, RFPL aj.), mikrosatelity, minisatelity, izoenzymová a alozymová analýza, imunologické metody • 14. 3. -  SNP, evoluce sekvencí, odhad evoluční vzálenosti • 21. 3. - Fylogenetické stromy I. - Proteinové distance, konstrukce fylogenetických stromů z matice distancí, anatomie stromů • 28. 3. - Fylogenetické stromy II. Rateheterogeneity, prohledávání prostoru stromů, maximální parsimonie • 4. 4. - Fylogenetické stromy III. - Metoda maximum likelihood, Bayéská metoda • Praktikum 7. 4.: Získávání sekvencí z veřejných databází (Karnkowska) • Biologický čtvrtek 10. 4.: Čtení stromu života z genomových sekvencí • 18 .4. - Fylogenetické stromy IV. - Multigenové analýzy, určení věrohodnosti větvení stromů, nalezení kořene, testy topologie, datování pomocí molekulárních hodin • 25. 4. - Speciace a hybridizace, kryptické druhy, příklady (Radka Reifová) • Praktikum 28. 4.: Tvorba alignmentu, tvorba stromů ze sekvencí DNA • 2. 5. -  Identifikace jedinců, určování rodičovství, DNA barcoding • Praktikum 5. 5.: Tvorba stromů ze sekvencí proteinů • 9. 5. Vnitrodruhová fylogeneze, struktura populace a genový tok, fylogeografie, příklady – odevzdání nepovinného eseje • Praktikum 12. 5.: multigenové analýzy, testy, distanční data, analýza migrace • 23. 5. - Prezentace studentů

3. MOLEKULÁRNÍ TAXONOMIE Zkouška Součásti zkoušky: Písemná část (5 příkladů) – maximální zisk 10 bodů Ústní část – maximální zisk 10 bodů Nepovinný esej (2-3 strany) a jeho prezentace (10 min.) – 4 body Hodnocení: 11-13 bodů – dobře 14-17 bodů – velmi dobře 18 a více - výborně

4. MOLEKULÁRNÍ TAXONOMIE Materiály ke studiu • WEB (Hampl): http://web.natur.cuni.cz/~vlada/moltax/ • Moodle: klíč k zápisu „moltax“ • WEB (Flegr): http://web.natur.cuni.cz/~flegr/moltaxmater.php • KNIHY • Flegr J. Evoluční biologie, Academia 2005. • Kapitoly: IX.Evoluce sekvence DNA a XXIV. Molekulární fylogenetika • Avise J.C. Molecular markers, natural history and evolution. Sinauer Associates, Inc., 2004 • Felsenstein J. Inferring phylogenies. Sinauer Associates, Inc., 2004 • Lindell Bromham Reading the story of the DNA. Oxford University press 2008. • Higgs P. a Attwood T.K. Bioinformatics and molecular evolution. Blackwell publishing 2005. • Sapp: The new foundation of evolution. Oxford university press 2009 • Yang: Computational Molecular Evolution. Oxford university press 2006 • Hillis a kol.: Molecular Systematics (2nd edition). Sinauer Associates 1996 • Wiley a Lieberman: Phylogenetics (2nd edition). Wiley-Blackwell 2011

5. Molekulární taxonomie Co to je za obor? Taxonomie (systematika) využívající molekulárně biologické znaky. Taxonomie (systematika) = Snaží se katalogizovat biodiverzitu a uspořádat ji do systému obvykle hierarchicky řazených skupin. Rozdíly v sekvenci DNA (potažmo proteinů). Nepatří sem znaky na jiným molekulách (lipidy, polysacharidy, proteoglykany, terciární struktury proteinů aj.)

6. Taxonomie Podle většinového názoru taxonomů je nejlepším přirozeným systémem organizmů ten, který odráží průběh jejich fylogeneze. Fylogenetika – zabývá se vznikem a vývojem linií organizmů. Rekonstruje průběh kladogeneze (větvení), ale všímá si i anageneze vývoje vlastností organizmů v rámci linie.

7. Taxonomie Existují různé názory na použitelnost znaků pro rekonstrukci fylogeneze: Fenetika (podobnost) – používá všechny znaky Kladistika(důraz na příbuznost) – používá výhradně synapomorfie x1 y1 z1 x1, y1, z1 = plesiomofie x2 = synapomorfie pro BCD y2 = autapomorfie pro B z2 = homoplázie (konvergence) pro ED

8. taxonomie Numerická taxonomie (60. minuleho století) – první pokus o objektivizaci taxonomie. Kladli důraz na použití velkého množství dat a vyvinuli matematické postupy, jak z nich vypočítat celkovou podobnost (nebo naopak odlišnost - distanci) mezi taxony. Je to tzv. fenetický přístup. Kritizovánikladisty za to, že jim nevadí homoplázie. Metody konstrukce stromů označované jako fenetické(založené na distancích) byly nebo jsou kladisty neprávem zavrhovány. Kladistické metody (maximální parsimonie)se v praxi dostávajído podobných obtíží, nemají vodítko, jak rozeznat homoplázie a konflikty mezi znaky řeší nakonec podobně jako „fenetické“ metody.

9. Taxonomie • Základním požadavkem na přirozený taxon je jeho monofyletičnost. • Monofyletický taxon je • takový, jehož členové si jsou vzájemně příbuzní více, než je kdokoli z nich příbuzný druhu mimo • jinak řečeno, takový, který zahrnuje všechny potomky jednoho předka Monofyletický (přípustný pro evoluční taxonomy i kladisty) Parafyletický (přípustný pro evoluční taxonomy) Polyfyletický (nepřípustný)

10. Taxonomie Na základě znalosti fylogeneze lze určit, které taxony vytvářet nesmíme, není však možné určit, které taxony vytvářet máme nebo musíme.

11. homologie Homologie jsou podobnosti mezi komplexními strukturami nebo vzory, které jsou způsobeny kontinuitou biologické informace. (Riedl a Hazsprunar) Synapomorfie a symplesionorfie = homologie Homoplásie ≠ homologie, je to analogie, ale někdy záleží na úrovni pohledu (křídlo ptáka, netopýra a pretodactyla).

12. homologie Homologický vztah indikuje: • Odpovídající poloha • Podobnost v detailech ACCTGGATGCACTTGAATGCACTTCGATGGACTTCAAGGG Alignment sekvencí ACCTGGATGCACTTGAATGCACTTCGATGGACTTCAAGGG

13. homologie Homologický vztah vyvrací: • Přítomnost obou struktur u jednoho druhu • Inkongruence s mnoha jinými znaky

14. Molekulární taxonomie Co to je za obor? Taxonomie (systematika) využívající molekulárně biologické znaky. Taxonomie (systematika) = Snaží se katalogizovat biodiverzitu a uspořádat ji do systému obvykle hierarchicky řazených skupin. Rozdíly v sekvenci DNA (potažmo proteinů). Nepatří sem znaky na jiným molekulách (lipidy, polysacharidy, proteoglykany, terciární struktury proteinů aj.)

15. Překvapivé množství polymorfismu Liší se asi ve 3 miliónech nukleotidů Kdyby tyto různé alely genů měnily fitness, byly by přírodním výběrem rychle eliminovány nebo naopak fixovány a žádný polymorfismus bychom v daných místech nepozorovali.

16. Neutrální teorie evoluce Liší se asi ve 3 miliónech nukleotidů Naprostá většina substitucí na úrovni DNA je selekčně neutrální neutrálních, mutanti mají stejnou fitness. Tyto mutace jsou pro selekci neviditelné a jejich fixaci či eliminaci způsobuje genetický drift (posun). Ten je u velkých populací pomalý, obě alely tam přetrvávají dlouho dobu a my je detekujeme jako polymorfismy.

17. Genetický drift

18. Neutrální teorie evoluce • Aby bylo jasno: • Neutrální teorie netvrdí, že většina genů je postradatelná, ale tvrdí, že většina forem (alel) téhož genu je funkčně stejně dobrá. • Neutrální teorie netvrdí, že nejsou mutace se škodlivým efektem, které jsou eliminovány přírodním výběrem, ale tvrdí že takových mutací je menšina. • Neutrální teorie nezavrhuje darwinistickou adaptivní evoluci poháněnou přírodním výběrem, ale tvrdí, že většina mutací je pro přírodní výběr „neviditelná“ a k adaptivní evoluci nepřispívá. • Neutrální teorie nejlépe vysvětluje, kde se bere tolik polymorfismu (rozdílů) v DNA.

19. Výhody molekulárních znaků 1. Jsou genetické Víme jak se dědí, nezávisí na prostředí ani genetickém pozadí. Je to právě ta úroveň kde vznikají evoluční novinky – mutace v DNA. 2. Je jich obrovské množství: Velikost genomů se pohybuje od 0,5*106 – 600*109. Lidský genom obsahuje přes 3 miliardy párů bazí. Odhaduje se, že lidé se mezi sebou liší v 0,1% tj 3 miliónech bazí.

20. Výhody molekulárních znaků 3. Jsou selekčně neutrální Podle nich snadněji rozlišíme homologii a homoplázii Sup africký Kondor andský Sup africký

21. Výhody molekulárních znaků 4. Jsou použitelné od těch nejvzdálenějších srovnání … ACCTGGATGCACTTGAATGCACTTCGATGGACTTCAAGGG

22. Výhody molekulárních znaků 4. … až po porovnávání jedinců téhož druhu

23. Výhody molekulárních znaků 5. Dají se jednoznačně popsat 6. Jsou nezávislé 7. Jsou lépe vážitelné 8. Lépe se kvantifikuje stupeň nejistoty ACCTGGATGCACTTGAATGCACTTCGATGGACTTCAAGGG 2 1

24. Výhody molekulárních znaků • Molekulární hodiny • Informace o populaci

25. Nevýhody molekulárních znaků • Neposkytují informaci o anagenezi • Cena • Někdy destruktivní charakter

26. Historie – 60. léta Linus Pauling, Emile Zuckerkandl (Molecules as Documents of Evolutionary History, 1964) Robert Sokal, Peter Sneath (Numerical taxonomy, 1963) Willi Henning (Phylogenetic systematics, 1966) Luigi Cavalli-Sforza, Anthony Edwards (metody maximální parsimonie a maximum likelihood, 1963-1966)

27. Historie – 60. – 90. léta Margaret Dayhoff (Atlas of protein sequence and structure, 1965) Motoo Kimura (Neutral theory of evolution, 1968) Masatoshi Nei (substituční modely, 80. léta) Joe Felsenstein (PHYLIP - Phylogeny Inference Package, 1995, artefakty fylogenetických metod – long branch attraction) (David Swofford – PAUP )

28. závěr • Pro tvorbu přirozeného systému je nezbytné znát fylogenezi organizmů • Je dovoleno vytvářet jen monofyletické případně parafyletické taxony • Molekulární znaky mají spoustu důležitých výhod • Molekulární znaky jsou vhodné pro studium studium kladogeneze nikoli anageneze • Molekulární znaky vznikají převážně neutrální evolucí a k jejich fixací přispívá genetický drift

29. SEKVENACE DNA

30. Cyklus 1 PCR Cyklická reakce zahrnující denaturaci templátu, nasednutí primeru a polymeraci. • Jednostranně ohraničené řetězce vznikají pouze z původní DNA templátu. • Oboustranně ohraničené řetězce jsou samy sobě templátem, jejich počet roste geometrickou řadou a po 30 – 40 cyklech zcela převáží nad ostatní DNA ve vzorku. Cyklus 2

31. Sangerova metoda - I PCR Amplifikace Vložení do plazmidu Sekvenace

32. Sangerova metoda - II G G G G Kapilární elektroforéza

33. Nextgenerationsequencing Díky masivní paralelizaci (najednou sekvenují milióny templátů ) dokáží v krátkém čase vygenerovat obrovské množství sekvencí. Cena za 1 bázi podstatně klesá.

34. 454 – emulzní PCR

35. 454 – destička

36. 454 - chemie

37. 454 - výstup

38. Ion torrent

39. Illumina – vazbanasklíčko

40. Illumina- amplifikace

41. Illumina - Čtení

42. Illumina- Čtení

43. Real Timesequencing • Pacific biosciences

44. závěr Porovnání některých parametrů technologií sekvenace DNA Metody jsou různě vhodné k různým účelům. Na „de novo“ sekvenování je nejvhodnější Sanger a 454 a Pacbio RS. Illumina je lepší na re-sekvenování. Někdy je dobré metody kombinovat.