Restrictie Enzymen

1. Restrictie Enzymen Bacteriele verdediging tegen virale infecties door restrictie- (knip) enzymen.

2. Restrictie Enzymen scannen de DNA sequentie • Vinden een zeer specifieke sequentie (volgorde) van nucleotiden • Maken een specifieke ‘knip’ in het DNA

3. Palindromen in DNA sequenties 5’ 3’ 3’ 5’ Genetische palindromen zijn gelijk aan taal palindromen. Bv. Lepel of parterretrap. Een palindroom sequentie in DNA bestaat uit een gelijke 5’ to 3’ nucleotide sequentie in beide ketens.

4. Restrictie enzymen herkennen en knippen in een specifieke palindroom sequenctie, de restrictie plek, in het DNA. Dit is meestal een sequentie van 4- tot 6 base paren.

5. Hae III 5’ TGACGGGTTCGAGGCCAG 3’ 3’ ACTGCCCAAGGTCCGGTC 5’ HaeIII is een restrictie enzym die ‘zoekt’ op het DNA molecuul tot het de onderstaande sequentie van 4 basen vindt.

6. Als de sequentie wordt gevonden knipt Hae III het DNA op deze plek. 5’ TGACGGGTTCGAGGCCAG 3’ 3’ ACTGCCCAAGCTCCGGTC 5’

7. Deze knip levert “blunt ends” 5’ TGACGGGTTCGAGG CCAG 3’ 3’ ACTGCCCAAGGTCC GGTC 5’

8. EcoRIbijvoorbeeld R stam van de E.coli bacterie Iomdat het, het eerste E. coli restrictie enzym was dat is gevonden. De namen voor restrictie enzymen komen van: • het type bacterie waarin het enzym is gevonden • De volgorde waarin het restrictie enzym is gevonden en geisoleerd.

9. “blunt ends” en “sticky ends” 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ Hae III produceert een “blunt end”? EcoRI maakt een gesplitste knip en produceert een “sticky end”

10. blunt end sticky end

11. Meer voorbeelden van restrictie plekken en restrictie enzymen met hun knipplekken Hind III: 5’ AAGCTT 3’ 3’ TTCGAA 5’ Bam HI: 5’ GGATCC 3’ 3’ CCTAGG 5’ Alu I: 5’ AGCT 3’ 3’ TCGA 5’

12. Het scheiden van Restrictie Fragmenten, I

13. Het scheiden van Restrictie Fragmenten, II

14. Gel elektroforese

15. The action of a restriction enzyme, EcoR I Note: EcoR I gives a ‘sticky’ end

16. DNA Klonering, II Bacteriele plasmides (klein circulair DNA die extra info bevatten naast het reguliere bacteriele DNA) worden geknipt met hetzelfde restrictie enzym Een deel ‘vreemd’ DNA kan dan dus worden ingebracht in het plasmide DNA. Zo ontstaat een “recombinant”

17. DNA cloning, III De recombinante plasmides worden dan gemengd met bacterien die zijn behandeld om makkelijker plasmides op te nemen Dit proces heet transformatie Dit transformeren kan uitgevoerd worden mbv een elektrische puls of een hitte-schok (heat-shock)

18. DNA Cloning, IV De plasmides bevatten genen voor antibiotica resistentie Bacterien die de plasmides bevatten kunnen overleven op platen met dit antibioticum –de anderen gaan dood, dus alleen de transformanten overleven.

19. Screening, I Andere screeningsmogelijkheden: Screening op fenotype- door de insertie van het ‘vreemde’ DNA wordt een voedingsstof uit de bodem niet meer omgezet in een kleurstof. Het gebruik van antilichamen die binden aan het specifieke eiwitproduct dat een goed gemodificeerde cel moet produceren.

20. Screening, II 3. Detecteren van de DNA sequentie van een gekloneerd gen mbv een probe (DNA hybridisatie)

21. Transgenen, de producten van genetische modificatie • http://www.bioplek.org/animaties/moleculaire_genetica/transgeneoverzicht.html Met behulp van de DNA sequentie, restictie-enzymen,ligase en specifieke communicatiesignalen die betrokken zijn bij natuurlijke recombinatieprocessen kunnen plasmiden volledig ontworpen worden. Hierdoor ontstaat de mogelijkheid om het modificatie en recombinatieproces te sturen.