ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS

ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS BIOMEDICINA FIEL DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO

Reações imunoquímicas • ANTÍGENO + ANTICORPO • Reação química especial • Reconhecimento do antígeno: • Superfície da célula • Disperso em solução • Anticorpos • Especificidade • Afinidade • Diversidade

Técnicas (métodos) utilizados • Reagentes não marcados • Precipitação (Floculação) e derivados • Aglutinação • Reagentes marcados • Radioativos - • RIA = Radio-imunoensaio • IRMA – Ensaio Imunoradiométrico • Não radioativos • Enzimáticos:1970- ELISA e seus “derivados” = EIA, EMIT, • Fluorescentes: FPIA, ELFA , FSF, Imunofluorescência • Quimioluminescentes : convencional, ou eletroquimioluminescência] • Blotting

Reações de Precipitação • Quantificação do precipitado (COMPLEXO ANTÍGENO-ANTICORPO) • Fatores interferentes: • Concentrações do antígeno e do anticorpo • Outros fatores físico-químicos (temperatura, pH) • Reação Antígeno x Anticorpo é REVERSÍVEL • O precipitado se dissolve quando há excesso de um dos componentes: FENÔMENO PR0-ZONA • Precipitação máxima: concentrações equivalentes de Antigeno (Ag) e Anticorpo (Ac)

Reações de Precipitação • Direta: Clássica: VDRL – RPS – SÍFILIS OU LUES • DERIVADAS MANUAIS • Imunodifusão • Imuno-eletroforese (contra imuno eletroforese) • Imunofixação • Eletroimunodifusáo • DERIVADAS AUTOMATIZADAS • NEFALOMETRIA E TURBIDIMETRIA

Nefalometria e Turbidimetria • Possibilidade de Automação total • Nefalômetros • Equipamentos de bioquímica • Dosagem de proteínas em sangue e outros fluidos (exemplo LCR) • Alfa 1 glicoproteína ácida (mucoproteína) • Fator Reumatóide • Microalbumina • Proteína C Reativa • Apoliproproteína

Reações de Aglutinação • Formação de agregados grandes de partículas com múltiplos determinantes antigênicos interligados por pontes moleculares de anticorpos; • Ligação: sítios antigênicos iguais em diferentes partículas • Detectam tanto a presença de IgM quanto de IgG • Visualização: depende do tamanho dos agregados formados • Pode ser realizadas em placas, tubos ou lâminas:

Reações de AglutinaçãoFatores interferentes: • Classe do Anticorpo envolvido; • Eletrólitos; • Macromoléculas Hidrofílicas; • Enzimas; • pH (6 a 8); • Tempo; • Temperatura

Falso Negativas • Quantidade pequena de anticorpos: • a partícula ficar com o anticorpo preso ‘a sua superfície (sensibilizada), não formando pontes e não aglutinando; • Quantidade muito grande de anticorpos (fenômeno Pró-zona)

TIPOS DE PARTICULAS UTILIZADAS • Determinantes antigênicos Naturais: • Hemácias – determinação grupo sangüíneo • Bactérias – SLIDEX meningites • Protozoários • Particulas inertes revestidas • Látex (mais comum) • Gelatina • Betonita, polipeptídeos • Células antigenicamente não relacionadas • Células revestidas com antígenos solúveis: ou com antígenos solúveis adsorvidos ou fixados • Hemácias e bactérias

Aglutinação: Técnicas mais Utilizadas • Aglutinação direta : ex teste de gravidez • Aglutinação passiva • Hemaglutinação direta: ABO RH • Hemaglutinação indireta: Toxoplasmose • Hemaglutinação Passiva • Inibição de Hemaglutinação • Inibição de Hemaglutinação passiva

Imunofluorescência • Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluocromos, mantendo a especificidade contra o antígeno. • Reagentes Utilizados: • Anticorpos Marcados (Fluocromos – Isotiocianato de Fluoresceína* ) • Glicerina Alcalina • Corantes (Azul de Evans)

Imunofluoresência direta • A reação Ag-Ac é detectada pela emissão de fluorescência • Pesquisa de antígeno • • amostra (Ag??) + Ac específico conjugado a substância fluorescente (conjugado)* • microscópio de fluorescência

IFI – Imunofluorescência INDIRETA A- pesquisa de antígeno • • amostra (Ag??) + Ac específico ®Ag-Ac * • • Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina * • • microscópio de fluorescência • • * lavagens B- pesquisa de anticorpos • • Ag (lâmina) + soro do paciente (Ac??) ® Ag-Ac * • • Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina * • • microscópio • • determinação do título e classe do Ac

Imunoensaios competitivos • Há competição entre a substância presente na amostra (ou o padrão) e outro marcado com alguma substância geradora de sinal, por uma quantidade limitada de anticorpos específicos – variante: Radioimunoensaio (RIA).

Imunoensaios NÃO COMPETITIVOS • São utilizados dois anticorpos, um ligado à fase sólida e outro marcado com alguma substância geradora de sinal, que se ligam a SUBSTÂNCIA em estudo - Mais preciso e reprodutível, e possui níveis de sensibilidadeanalítica superiores. Desvantagem, precisam ter dois epítodos. Variante: Imunométrico

TIPOS • Radioimunoensaio (RIE) • Imunorradiométrico (IRMA) • Enzimaimunoensaio (EIA) • Imunofluorimétrico (IFMA, FPIA, ELFA) • Quimioluminescencia (ICMA)

Ensaios Enzimáticos, Fluorescentes ou Quimioluminescentes : • Competitivos • Não competitivos • Sequenciais • Sanduíche • Fatores Interferentes: • Reação cruzada: Ocorrem devido a, baixa especificidade dos anticorpos utilizados e o uso de anticorpos policlonais. • Presença de Anticorpos Heterófilos: Resultados falso positivos ou altos em pacientes transplantados ou submetidos a tratamento com antoicorpos monoclonais

Fatores interferentes II • Contagem de fundo elevada (Background) Leituras mais elevadas do que as reais por ligação inespecífica de constituintes do soro ao suporte sólido, lavagens inadequadas ou conjugados de pobre afinidade. • Efeito HooK Resultados menores do que o esperado na quantificação de substâncias que na realidade encontram- se elevadas, bloqueando a ligação.

ETAPAS ELISA, EIA • sensibilização (ou cobertura) da fase sólida: adição de Ag ou do Ac • bloqueio (proteína inerte: soro fetal bovino, leite desnatado) * • adição da amostra (em diluente) * • adição do conjugado: anticorpo purificado marcado com enzima (ex: peroxidase) * • adição do substrato cromogênico: peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD (ortofenilenodiamina) • interrupção da reação: SDS ou ácido • leitura: leitor de ELISA * lavagens

QUIMIOLUMINESCÊNCIAPra que serve??? Qual vantagem? • UTILIDADES: • Dosagem de marcadores tumorais (PSA, CA-125, CA 15-3, CA-19-9, CEA, AFP) • HORMÔNIOS • DOENÇAS INFECCIOSAS: HIV, Hepatites, • VITAMINAS • DOSAGEM DE IGE TOTAL • HOMOCISTEÍNA • VANTAGENS: • Sensibilidade – 10 x maior na troca de substrato cromogênico por um luminescente

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