El Centro Activo Enzimático

1. El Centro Activo Enzimático

2. La evidencia cinética lleva a concluir que las enzimas • funcionan a través de la formación de un complejo ES • El complejo ES es estequiométrico: existe una relación • entera entre número de moléculas de enzima y número de • moléculas de substrato (1:1, 1:2, etc) • La fijación de S a E es estereoquímicamente específica, y S • puede ser desplazado de su fijación por análogos estructurales • (inhibidores competitivos) • De todo lo cual se deduce que el substrato se fija a una región • específica de la molécula enzimática, llamada Centro Activo

3. Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 1 1. Formación de complejo ES evidenciable cinéticamente 2. Presencia de grupos prostéticos que participan en la catálisis 3. Fenómeno de la inhibición competitiva y efecto de los análogos de estado de transición 4. Efecto de inhibidores irreversibles: - Organofosfóricos sólo reaccionan con Serina “activa” - Clorometilcetonas sólo reaccionan con Histidina “activa”

4. Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 2 5. Estudios filogenéticos en secuencias de aminoácidos en enzimas Tripsina CQGDSGGPV Quimotripsina CMGDSGGPL Elastasa CQGDSGGPL Trombina CEGDSGGPF Plasmina CQGDSGGSW Pr. Sorangium GRGDSGGST Pr. St.griseus CQGDSGGPV

5. Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 3 6. Estudios de fijación de análogos de substrato marcados 7. Estudios estructurales por cristalografía de rayos X de enzimas cocristalizadas con su substrato (p.e., lisozima) 8. Otras técnicas físicas (RMN, RSE, polarización de fluorescencia)

6. Lisozima y su substrato

7. Número de centros activos 1. Estudios de fijación de ligandos 2. Número de grupos prostéticos 3. Reactivos específicos de centro activo (Organofosfóricos) 4. Titulación directa del centros activos

8. Estudio de fijación de ligandos Consisten en incubar la enzima con un análogo del substrato debidamente marcado (radioactivo, fluorescente, etc.), a dife- Rentes concentraciones de ligando. Ligando libre y ligando unido pueden separarse por: - Diálisis de equilibrio - Ultrafiltración - Cromatografía de exclusión en gel.

9. Aminoácidos presentes en el centro activo de enzimas • Serina: enzimas inhibidas por organofosfóricos • Histidina: enzimas inhibidas por clorometilcetonas • Cisteína: enzimas inhibidas por reactivos –SH • Lisina: enzimas que forman bases de Schiff • - Aspartato y Glutamato: dependencia de pH

10. Mecanismos de acción enzimática, 1 1. Efectos de proximidad y orientación Las enzimas logran en su centro activo una concentración local de reactivos mucho mayor que cuando éstos están en solución (efecto de proximidad) Además, la fijación al centro activo se hace en la orienta- ción correcta (efecto de orientación)

11. Colisiones no productivas Colisión productiva En la superficie de la enzima, los reactivos se encuentran en la orientación correcta y a una concentración local mucho mayor que en solución

12. Mecanismos de acción enzimática, 2 2. Catálisis general ácido-base 3. Formación de intermediarios covalentes 4. Otros efectos (efectos cuánticos, por ejemplo)

13. Mecanismo de la ribonucleasa pancreática, 1

14. Mecanismo de la ribonucleasa pancreática, 2

15. Mecanismo de las serinproteinasas 2 1

16. Mecanismo de las serinproteinasas 3 4

17. Mecanismo de las serinproteinasas 5 6

18. Mecanismo de las serinproteinasas 7 8

19. Asp 102 His 57 Ser 195 Configuración en el centro activo de la Quimotripsina, con un inhibidor