Analyse de liaison, dose-effet

1. Analyse de liaison, dose-effet 2 sites différents, coopérativité positive?

2. Of Cours 3

3. Courbes dose-effet, courbes de liaison Of Cours 3

4. Of Cours 3

5. Calcul de la EC50 et de la IC50 Of Cours 3

6. Of Cours 3

7. Conclusion: • La EC50 dépend uniquement du dénominateur, qui décrit Rtot • La IC50 dépend uniquement du dénominateur, qui décrit Rtot • Si on mesure dans les mêmes conditions d’incubation la courbe de liaison et la courbe dose effet, EC50 et IC50 doivent être identiques. Of Cours 3

8. Compétition: Saturation: Liaison ligand-récepteur : rappel Of Cours 3

9. Liaison « coopérative » Of Cours 3

10. Correspondance IC50-EC50 absolue? • Voir fichier « Excell »! (« Binding-Effet.xls ») Of Cours 3

11. Structures des récepteurs et activation Une ou plusieurs conformations actives?

12. Familles de récepteurs • Transmembranaires: • Canaux ioniques contrôlés par les ligands • Signalisation très rapide, plusieurs Sous Unités(4-5),plusieurs TM (4-5 par sous unité) • G-protein coupled receptors • Signalisation rapide (msec), 7 TM, vraisemblablement dimères • Récepteurs à activité enzymatique ou recrutant des enzymes • 1TM dimères ou multimères • Nucléaires et cytoplasmiques • Protéines solubles, • Homo- or hétéro-dimères Of Cours 3

13. Vraisemblablement: 3 Sous Unités 4 Sous Unités 5 Sous Unités Canaux: Au moins 3 “super families” avec plusieurs hélices TM Of Cours 3

14. Récepteurs canaux ioniques 2 (ou 3) états: Ouvert Fermé Désensibilisé

15. Récepteurs de l’acetylcholine (nicotinique): • Canal Na+, ouvert en réponse à la liaison d’ AcetylCholine • 5 Sous-Unités, chacune 4 hélices TM Of Cours 3

16. Liaison, effet biologique R AcCh R Glycine Of Cours 3

17. Deux ou trois états? (α7-AcChR-L247T) (α7-AcChR-wt) Of Cours 3

18. Effecteurs allostériques? • Reconnaissent de préférence état ouvert et le stabilisent • Reconnaissent de préférence état désensibilisé et augmentent l’ouverture Effet sur la liaison d’agoniste? Of Cours 3

19. 4 1 3 2 2 2 2 2 Of Cours 3

20. g a d b a 2 2 2 2 2 Extracellular ring E/Q Gate L Central ring (selectivity filter) S Intermediate ring E/Q Of Cours 3 D Intracellular ring

21. Acetylcholine Binding Protein: empty or antagonist-bound Of Cours 3

22. Acetylcholine Binding Protein: empty oragonist-bound Of Cours 3

23. Structure 3-D Récepteur AcCh Of Cours 3

24. Of Cours 3

25. Acetylcholine Binding Protein AcChol AcChol AcChol AcChol AcChol Of Cours 3

26. Activation of acetylcholine R Of Cours 3

27. Conclusion: • Nombre limité de conformations: ouvert, fermé, désensibilisé • La conformation ouverte est « sur le chemin » entre la conformation fermée et désensibilisée. • Le passage direct entre la conformation fermée et la conformation désensibilisée semble (généralement) très improbable. (forte barrière énergétique?) Of Cours 3

28. Récepteurs cytosoliques et nucléaires Conformation dépendante du ligand (“Main dans un gant”)

29. GR GR Protein synthesis GR GR Preinitiation complex HSP90 p59 GR HSP90 Of Cours 3

30. Structure modulaire: Of Cours 3

31. Two mechanisms of ERtranscriptional activation Direct (Binding to ERE) TFIIH TFIIF RNAPII TFIIB TFIIE TFIIA TFIID TBP ER ERE TATA Indirect(Binding to other TF’s) PCAF TFIIH TFIIF ER RNAPII CBP/p300 TFIIB TFIIE TFIIA TFIID Sp1 TBP Sp1 c-Jun c-Fos TATA GC AP1 Of Cours 3

32. DNA Binding? Major groove Minor groove Of Cours 3

33. DNA Binding domain: Of Cours 3

34. Ligand Binding Domain: Of Cours 3

35. Estrogen-receptor recognition: Of Cours 3

36. Empty, inactive and active ligand-bound receptors Laszlo Nagy and John W.R. Schwabe, TRENDS in Biochemical Sciences Vol.29 No.6 June 2004 Of Cours 3

37. Cinétiques de liaison?Courbes dose-effet? Albers et al, JBC 2006 Of Cours 3

38. Conclusion: • Il y a autant de conformations « actives » que de ligands • L’activité biologique de chaque ligand dépend de l’affinité relative des coactivateurs et des corépresseurs pour le complexe ligand-récepteur. • Un composé peut être agoniste partiel soit parce qu’il reconnaît les coactivateurs avec une mauvaise affinité, soit parce qu’il reconnaît également coactivateurs et coinhibiteurs Of Cours 3

39. Récepteurs de l’insuline Tyrosine kinase, 1 TM helix; Coopérativité négative, Relations liaison – activation?

40. Courbes de compétition, de saturation1 site ou 2 sites ? Surinya, K. H. et al. J. Biol. Chem. 2002;277:16718-16725 Of Cours 3

41. Cinétique de dissociation avec ou sans excès d’insuline Surinya, K. H. et al. J. Biol. Chem. 2002;277:16718-16725 Of Cours 3

42. S S S S S S Y960 Y960 Y1146 Y1146 Kinase Kinase Y1150 Y1150 Y1151 Y1151 Y1316 Y1316 Y1322 Y1322 Insulin Receptor α – Binding β – tyrosine kinase Of Cours 3

43. Insulin: two binding sites Of Cours 3

44. InsulinR α subunit SNI INS Of Cours 3

45. INSULIN RECEPTOR a Insulin b b a a b b a a b b a Of Cours 3

46. INSULIN RECEPTOR a Insulin b b a a b b a a b b a Of Cours 3

47. a a a a a a INSULIN RECEPTOR Insulin b b b b b b Of Cours 3

48. Dose-effet [Physiologiques] -10 -9 - 8 -7 -6 -5 Of Cours 3 [Insuline] (log M)

49. Insulin S S S S S S SOS PH Y960 Y960 pY STAT 5B IRS-1/2 Y1146 Y1146 Kinase Kinase Y Y699 Y1150 Y1150 Y1151 PI3K Y1151 pY pY Y1316 Y1316 GRB2 Y pY699 pY699 Y1322 Y1322 STAT 5 STAT 5 STAT 5 STAT 5 pY699 pY699 PP PP AP-1 CRE NFκB Insulin Receptor Signaling Effects on gene expression SH2 PH Prolinerich PTB RAF RAS MEK1/2 p27KIP ERK1/2 BAD STAT 5B pathway PDK mTOR PKB aPKC Caspase 9 GSK3β IKK p70S6K FOXO1 TCF Of Cours 3

50. Conclusion • 2 états du R insuline: • Au repos, en l’absence d’insuline: hélices TM mal placées donc TyrKinase inactive, • En présence d’insuline: Tyr kinase active, autophosphorylation, recrutement de protéines de signalisation. • Liaison: Possibilité de liaison simultanée de 2 insulines/R. Coopérativité négative entre les deux sites de liaison. Of Cours 3