Speciální světelná a elektronová mikroskopie

1. Speciální světelná a elektronová mikroskopie

2. Dozvíte se něco o: Speciální světelné mikroskopii • Zástin a fázový kontrast • Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) • Hoffmanův modulační kontrast • Fluorescenční mikroskopie • Konfokální mikroskopie Elektronové mikroskopii • Řádkovací (skanovací) • Prozařovací (transmisní)

3. Interference a ohyb (difrakce)světla

4. Interference a ohyb (difrakce)světla

5. Typy preparátů • Amplitudové = zbarvené objekty absorbující světlo - rovnoměrně, jeví se jako tmavé - různě, jeví se jako barevné • Fázové = nebarevné objekty, lišící se indexem lomu a tloušťkou Jejich kontrast lze zvýšit - barvením preparátů - optickými metodami

6. Metody zvýšení kontrastu • Zástin:clona zachycuje paprsky procházející přímo do objektivu, preparát je osvětlen z boku • Fázový kontrast:rozdíly v posunu fáze světla, které neumíme vnímat, převádí na rozdíly v jeho intenzitě

7. Fázový kontrast

8. Preparát č. 2:Entamoeba invadens (fázový kontrast)

9. Preparát č. 1:Tritrichomonas foetus (fázový kontrast)

10. Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC): zobrazuje optický reliéf, který je u biologických objektů zpravidla shodný s reálným prostorovým reliéfem

11. Metody zvýšení kontrastu Hoffmanův modulační kontrast (HMC):podobný výsledek jako DIC, levnější, nevyžaduje polarizované světlo – proto jím lze pozorovat i objekty na dvojlomných podložkách (plastikové misky)

12. Preparát č. 4:Trypanoplasma borreli (DIC)

13. DIC (Nomarského kontrast)

14. Luminiscence Chemiluminiscence luciferáza – luciferin Excitace zářením: fosforescence fluorescence

15. Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl

16. Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl Přímá vazba fluorochromu DAPI, ethidiumBr, propidium jodid

17. Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl Přímá vazba fluorochromu DAPI, ethidiumBr, propidium jodid Nepřímá vazba fluorochromu pacific blue, alexa fluor 488, FITC, TRITC, alexa fluor 635

18. Imunofluorescence F F F F F F vazba sekundární protilátky s konjugovaným fluorochromem (FITC apod.) vazba primární protilátky s konjugovaným fluorochromem (FITC apod.) vazba primární protilátky

19. Fluorochromy GFP Vložení genu pro fluorochrom přímo do genomu GFP, RFP, YFP, CFP

20. Filtry: excitační a bariérový

21. Filtry: excitační a bariérový

22. Filtry:excitačnía bariérový&dichroické zrcátko

23. Filtry:excitační a bariérový&dichroické zrcátko

24. Fluorescenční mikroskop

25. Co znamená „konfokální“?

26. Obraz je rekonstruován počítačem Zdrojem světla je laserový paprsek Je snímán jen obraz ze zaostřené roviny preparátu Konfokální mikroskop

27. Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie imunologie – lokalizace epitopů FITC, DAPI…

28. Imunolokalizace

29. Imunolokalizace

30. Imunolokalizace

31. FISH Fluorescence In Situ Hybridization

32. Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie Imunologie: lokalizace epitopů FITC, DAPI… Genomika: exprese a funkce genů GFP, RFP, YFP, CFP

33. Využití GFP

34. Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie Imunologie: lokalizace epitopů FITC, DAPI… Genomika: exprese a funkce genů GFP, RFP, YFP, CFP Proteomika: sledování pohybů a interakcí proteinů in situ PA-GFP, FRAP,FRET

35. Barvení DAPI Trypanosoma cyprini Tritrichomonas foetus

36. Barvení DAPI • Po zaschnutí preparátu fixace chemikáliemi vychlazenými na -20oC : • methanol 5´ • aceton 5´ • Po oschnutí barvení - kápnout 1 kapku DAPI a přiklopit krycím sklem

37. Elektronová mikroskopie • Proč elektrony? • Zvětšení elektronového mikroskopu • Co lze pozorovat? • Jak připravit mikroskopický preparát? • Vady mikroskopu

38. Proč elektrony? Rozlišovací schopnost vzdálenost dvou bodů, jež jsme schopni vnímat samostatně oko asi 0,25mm U mikroskopu odpovídá polovině vlnové délky použitého záření = cca. 0,2 µm Světelný mikroskop: 1000 x víc než oko

39. Zvětšení elektronového mikroskopu Rozlišovací schopnost Rozlišovací schopnost oka: asi 0,25mm Vlnová délka příslušející urychlenému elektronu (60kV) je přibližně 0,005nm => rozlišovací schopnost 0,0025nm 0,25/2,5.10-7 = 100 000 000 x víc než oko Prakticky 350 000 – 500 000 xvíc než oko Špičkové přístroje až800 000 – 1 000 000 x

40. Typy elektronových mikroskopů • TEM • SEM (ESEM, LVSEM, AQUASEM) • Další typy elektronových mikroskopů (STEM)

41. TEMTransmisní elektronový mikroskop • Pracovni vakuum v mikroskopu - cca 10-4 Pa • Zdrojem záření je elektronové dělo (žhavené wolframové vlákno, LaB6, autoemisní tryska) • Čočky jsou elektromagnetické • Obraz nelze pozorovat přímo, projektován na: • fluorescenční stínítko • fotografickou desku • prostřednictví SSC kamery na monitor • Potenciální rozdíl napětí katoda x anoda je cca 60 – 200 kV u vysokovoltové el. mikroskopie 200 – 1000kV

42. Příprava preparátu Fixace - usmrcení tkáně, konzervace koagulací bílkovin Postfixace Odvodnění – postupné šetrné nahrazení vody ve vzorku organickým rozpouštědlem Zalití do umělé pryskyřice – strukturální podpora pro řezání vzorku Řezání – tenké řezy, maximálně do 100nm Kontrastování – adsorpce atomů těžkých kovů na urč. struktury vzorku • Mrazové preparáty - složitá identifikace obrázků • Mrazové lámání • Mrazové leptání

43. SEMSkenovací elektronový mikroskop • Pracovní vakuum 10-2 Pa • Zdrojem záření je elektronové dělo (žhavené wolframové vlákno, LaB6, autoemisní tryska ) • Čočky fokusují paprsek do co nejmenšího stopy • Primární paprsek elektronů řádkuje plochu na preparátu a při interakci as hmotou preparátu se uvolňují z preparátu sekundární elektrony • Obraz je tvořen bod po bodu a projektován na obrazovku • Zvětšení = řádkovaná plocha/velikost obrazovky (běžně 10 000 - 20 000 x ) • Potenciální rozdíl napětí katoda x anoda je do 50kV

44. Preparáty • Až několik cm velké • Dokonale vysušené objekty, při maximálním zachování povrchových struktur • Povrch je pokoven tenkou souvislou vrstvou

45. Informace převážně z Vesmíru Kontrast a fáze: • Jaromír Plášek, Josef Reischig: Kontrast v optické mikroskopii. 1995/11, str. 638 •  Jaromír Plášek: Prostorové zobrazení preparátů. 2000/3, str. 137 Fluorescenční a konfokální mikroskopie: • Jaromír Plášek: Konfokální mikroskop. 1995/9, str. 508 • Jiří Beneš, Milan Hadravský, Alan Boyde, Mojmír Petráň: Optické mikroskopy s velmi vysokým rozlišením. 1997/11, str. 616-622 • Jaromír Plášek: Prostorové zobrazení preparátů. 2000/3, str. 137 • Jaromír Plášek: Proměny světelné mikroskopie ve 20. století. 2004/3, str. 146-153 • Lucie Kubínová: Konfokální a dvoufotonová mikroskopie. 2004/3, příloha Mikroskopie dnes str. M4 • Mojmír Petráň: Mikroskop s dvojitým řádkováním. 2004/3, příloha Mikroskopie dnes str. M6 • Jan Bendnár, David Staněk, Jan Malínský, Karel Koberna, Ivan Raška: Dnešní mikroskopie v biomedicíně. 1983/10, str. 581-585 • Jaromír Plášek: Víc než pouhý mikroskop. 2004/10, str. 586 Lucie Kubínová: Pohledy do trojrozměrného mikrosvěta: konfokální a dvoufotonová mikroskopie, Živa 6, 2006, str. 245

46. Informace z Vesmíru Elektronová mikroskopie: • Luděk Frank: Kam směřuje elektronová mikroskopie? 2004/3, příloha Mikroskopie dnes str. M2 • Armin Delong: Padesát let elektronové mikroskopie a elektronového mikroskopu v Brně. 2004/3, příloha Mikroskopie dnes str. M7 • Jana Nebesářová a Pavel Honzák: Současná elektronová mikroskopie v biologii. 2004/3, příloha Mikroskopie dnes str. M9 Speciální mikroskopie „bez čoček“, krok k nanotechnologiím: • Jan Valenta: Spektroskopie jednotlivých molekul v blízkém optickém poli. 1995/4, str. 236 • Pavel Svoboda: Fuellerenový hrot… 1996/12, str. 708 • Pavel Janda, Jan Weber: Mikroskopie rastrovací sondou. 1998/7, str. 381 • Jan Valenta: Jediná molekula jako lampička osvětlující vzorek. 2000/11, str. 606