Klasifikasi , Mekanisme dan Aplikasi Enzim DNA Ligase

1. Klasifikasi, MekanismedanAplikasiEnzim DNA Ligase Abdul Arifin 20508013

2. Klasifikasi DNA Ligase Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) EnzimNomenklatur DNA Ligase (ATP) EC.6.5.1.1 Strukturmolekul Definisi; DNA Ligase: salahsatuenzimligase yang membentukikatankovalenfosfodiesterdiantaraujung 3’Hidroksi darisatunukleotidadenganujung 5’fosfat darinukleotida yang lain danmelibatkan ATP dalamreaksinya. SisiAktif (Lysine) MekanismeReaksi SecaraUmum; (DNA)n + (DNA)m (DNA)n+m DNA Ligase ATP AMP + Ppi

3. Mekanisme DNA Ligase NH-AMP DNA ligase PP1 NMN E.coli T4 ATP NAD+ NH2 AMP DNA ligase Ligated DNA Suaturantai DNA yang terpisah Transfer gugusadenosilkeujung 5’ fosfatpada DNA yang terpisah Gugushidoksilmenyerangujung 5’ fosfat – adenosil - enzim Pembentukan intermediate enzimenergitinggidengan transfer gugusadenosildari NAD+atau ATP padagugus amino dariresidu lysine

4. Tipe-tipe DNA Ligase • PadaHewanMamaliaterdapat 4 tipespesifikdarienzim DNA Ligase, diantaranya ; • DNA Ligase I : yang mengkatalisreaksiligasifragmen-fragmen Okazaki padapemanjanganrantaisewaktuprosesreplikasi DNA berlangsungdanbeberapafragmen-fragmenrekombinasi • DNA Ligase II : Bentuk alternative dari DNA Ligase III yang ditemukanpadasel yang tidakdapatmembelahdiri • DNA Ligase III : Bentukkompleksdengan XRCC1 suatu protein yang memperbaiki DNA denganmencegahterjadinyamutasipenghilanganbasa DNA danfragmen-fragmenrekombinan • DNA Ligase IV : Bentukkompleksdengan XRCC4. Kompleksenziminimengkatalisistahapakhirprosesperbaikanpenggabunganujung non-homolog DNA rantaiganda. Umumnya enzim-enzim DNA ligase pada mulanya ditemukan dalam T4 bakteriofag, E. coli dan bakteri lainnya.

6. Regulator DNA Ligase Regulation of DNA Ligase activity by poly(ADP-ribose) yang disusun oleh Debbie Creissendan Sydney Shall dalam Nature 296, 271-272 (18 March 1982) Nuclear ADP-ribosyltransferase (ADPRT) menkatalisis transfer ADP-ribosdari NAD+ ke protein Kromatinuntukmembentuk mono-,oligo-, and poly (ADP-ribose)-termodifikasi. Enziminisangattergantung DNA untukaktivitasnyadandiaktivasidenganadanyacelahdalam DNA. Hal inimengindikasikanbiosintesis poly(ADP-ribose)n dibutuhkanuntukperbaikan yang efektifuntukbeberapajeniskerusakan DNA. Regulation of inter- and intramolecular ligation with T4 DNA ligase in the presence of polyethylene glycol yang disusunoleh Hayashi, K., et. al., yang dipublikasikandalam Nucleic Acids Research, 1986, vol. 14, No.19 7617-7631 Polyethylene glycol (PEG) mempengaruhireaksiligasipada T4 DNA ligase. Dalam 10% (w/v) larutan PEG 6000, hanyaligasiintermolekular yang dipertinggiolehkation-kationmonovalent, sementarareaksiligasi inter- danintramolekulardapatterjaditanpa PEG.  Cell cycle regulation of a DNA ligase-encoding gene ( CaLIG4) from Candida albicans DisusunolehAndaluz, E., et. al., yang dipublikasikandalam Yeast volume 15 issue 12, 1999, p1199-1210 menjelaskantingkattranskripsienzimCaLIG4dalamC. albicansbervariasiselamasiklusselragi. Sel-sel yang baruterbentukmengandungtingkattranskripsibasa yang meningkatsampaitingkatmaksimumketikaseldalamkeadaan G1akhir. Sesudahitu, tingkatranskripsimenurunketikareplikasi DNA dimulai.

7. IsolasidanKarakterisasi DNA Ligase Isolasi gen DNA ligasedariThermococcus sp. 1591 Denaturasi pisahkan gen DNA ligasemenjadi DNA rantaitunggaldenganpemanasan 94oC selama 1 menit gabungkan primer kerantaitunggal DNA, dengansuhu 50oC/140 detik Annealing Primer merupakanurutandaerahdari DNA ligaseorganisme x pembentukanrantaikeduadengan DNA polymerase dandNTPpadasuhu 72oC selama 1,5 menit Extension Dilakukan PCR sampai 40 siklus, Fragmen yang dihasilkan (total panjang 600nt), yang miripdengan gen DNA ligaseorganisme x

8. DNA Thermococcus sp. 1591 Isolasi gen DNA ligasedariThermococcus sp. 1591 Primer 1 and 2 Membentuk gen utuh. Gen DNA ligaseutuh

9. KarakterisasiDNA Ligase Aktivitasligasedapatditentukanmelaluiduametode Salahsatusampelditambahkan DNA ligase 1.Molekul DNA kontrol 2. DNA setelahpenambahanenzimrestriksiBstEII 3. Samaseperti 2, tetapisebelumelektroforesissampelnyadipanaskan 70oC selama 10 menit 4. Sampelfragmen DNA + BstEIIdenganpenambahan DNA ligase (45oC/1jam), buffer reaksiserta ATP 5. Miripdengan 4 tetapitanpa ATP C = produkligasi (fragmen A + B) A dan B= fragmenhasilrestriksiBstEII

10. Aplikasi DNA Ligase Percobaanpertama DNA rekombinan • 1971 ilmuwanmemanipulasi DNA danmenempatkannyakedalambakteri • 1972 ilmuwanmenggabungkanduamolekul DNA darisumberberbedamenggunakanendonucleaseEcoRI (untukmemotong) dan DNA ligase (untukmenggabungkankembali)

11. Aplikasi DNA Ligase Kloning DNA pertama • Boyer, Helling Cohen, dan Chang menggabungkanfragmen-fragmen DNA dalamsebuah vector, danmentransferkeselE. coli • Cohen and Chang menyimpulkan, merekadapatmenempatkan DNA bakterikedalamspesiesbakteri yang berlainan • Tahun1980 Boyer and Cohen menerima paten untukmetodedasartransformasidankloning DNA

12. Aplikasi DNA Ligase DNA ligasedimanfaatkanuntukmenggabungkansecarakovalenikatanfragmen-fragmensuatu DNA, secaraluaskemampuaninidiaplikasikankepenggabungansuatufragmen DNA padasuatuvektor plasmid, halinimerupakanteknikdasarrekombinasi DNA OrganismaModifikasiGenetik: Aplikasi DNA Ligasedalam Agriculture Agrobacterium DNA mengandung gen yang diinginkan Plant cell 1 2 3 Tiplasmid Regenerasitanaman RekombinanTi plasmid Pemasukan gen kedalam plasmidmenggunakanenzimrestriksidan DNA ligase pengenalanke dalam sel tanaman yang dikembangkan T DNA T DNApembawagen barudalam kromosom tanaman Tanaman hasil rekayasa Titikrestriksi

13. PerkembanganAplikasiDNA Ligase 1 Isolat DNAdari dua sumber Sel Manusia E. coli 2 Potong kedua DNA dengan enzim restriksi yang sama Plasmid DNA Gen V Sticky ends campurkan DNA; merekabergabung berdasarkan pasangan basanya 3 Paul Berg, Stanley N. Cohen & Herbert Boyer, 1970 (p.1119) Klon DNA : (teknologi DNA rekombinanataurekayasagenetik) 1. Potong DNA padaposisitertentudenganenzimrestriksiendonuklease. 2. Gabungkankeduafragmen DNA denganDNA ligase. 3. Pilihmolekulkecil yang mampumereplikasiDNAnyasendiri. Potongan DNA dapatdimasukkankedalamkloningvektor (plasmid atau viral DNA) untukmembentukDNA rekombinan. 4. Pindahkan DNA rekombinandaritabungteske sell indukuntukreplikasi. 5. Identifikasi cell induk yang mengandung DNA rekombinan. 4 DNA ligase menggabungkanikatan DNA secara kovalen Gen V Rekombinan DNAplasmid 5 plasmid dimasukkan ke bakteri 6 bakteri diklon Klon bakteri mengandung duplikat gen manusia

14. “BerasKeemasan” telahdimodifikasisecaragenetik agar meengandung beta-karotene Berasinidapatmenolongmencegahterjadinyadefisiensiterhadap vitamin A KloningSel-selHewan, Langkahmenujugen terapi Tanamantembakakau, diekspresikandengan gen firefly luciferase TikusRekayasa (Kanan), yang diekspresikan dengan gen HGH (Human Growth Hormone)

15. Sel-seldanorganismerekombinandigunakanuntukmenghasilkan protein-protein yang bermanfaat

16. Kesimpulan