440 likes | 640 Views
Rekayasa Enzim dan Metagenom. Keanekaragaman Protein. Keanekaragaman hayati Rekayasa Protein. Pembuatan Mutan Directed Random Recombination. Rational Protein Design. Perubahan asam amino/urutan spesifik Ideal: perubahan sifat yang dapat diprediksi
E N D
Keanekaragaman Protein • Keanekaragaman hayati • Rekayasa Protein
Pembuatan Mutan • Directed • Random • Recombination
Rational Protein Design • Perubahan asam amino/urutan spesifik • Ideal: perubahan sifat yang dapat diprediksi • Memerlukan informasi struktur protein dan ‘intuisi’
Efficient & Rational Protein Design • Interdisiplin • Gen berada dalam vektor ekspresi yang baik • Struktur 3-D protein • Computer modelling • Struktur 3-D protein homolog, jika tidak ada informasi struktur • Informasi struktur-fungsi dari protein homolog/related
Directed • rational (site directed mutagenesis) G TAC GGC CCG TAA A C CGC ATC TTT AAA AAA AAT ATG CCC GGC ATT TTG GCG TAG AAA TTT TTT TTA
Perbaikan Stabilitas Protein • Penambahan ikatan disulfida: • Lokasi sistein berdekatan pada struktur 3 D • Bukan merupakan pusat aktif • Tidak merubah struktur • Mengganti asam amino yang dapat teroksidasi asparagin dan glutamin. • Penambahan ikatan hidrogen, jembatan garam, interaksi hidrofobik
Varian • Streptokinase • WT • Lys386Gln • Lys59Gln • Lys386Gln, Lys59Gln • Mutasi menyebabkan protein menjadi tahan terhadap plasmid
Random: Error prone PCR • Kesalahan pada saat polimerisasi oleh DNA polimerase • Penurunan fidelitas DNA polimerase oleh ion Mn2+ • Penurunan konsentrasi nukleotida • Peningkatan siklus PCR • Terbatas pada fragmen berukuran kecil ( <800pb)
Recombination: DNA shuffling • Stemmer WP. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 1994 370, 389-91 • Pencampuran materi genetik dari induk yang berbeda • DNA induk dipotong dengan DNaseI • Fragmen acak mengalami proses denaturasi, annealing, dan perpanjangan yang dikatalisis oleh DNA polimerase
Recombination Family shuffling • Extention of technique to homologous genes • Need >60% similarity 1. Fragment 2. Reassemble
Recombination DNA shuffling Wt gene Error prone PCR or other method DNase I fragmentation
α-Amylase Bacillus amyloliquefaciens • Temperatur optimum 50oC-70oC • pH optimum 6 • Likuifasi pati dan detergen • Site directed mutagenesis: BAA S201N (pada pH 10 aktivitas meningkat 16%; pada pH 10 aktivitas meningkat 50%) dan BAA N297D (pada pH 10 aktivitas sama dengan WT; pada pH 11 aktivitas meningkat 50%) • Error prone PCR: 7200 klon – 16 mutant • DNA shuffling: 10.000 klon: 960 klon positif berdasarkan uji staining. • Penapisan ulang: BAA42 (pH optimum 7, aktif pada daerah pH yang lebih luas, aktivitas meningkat 5 x pada pH 10) dan BAA 29 (profil pH sama dengan WT, aktivitas spesifik meningkat 9 x)