توليد كارآمدگياهان هاپلوييد به منظور ايجاد لاين هاي ( Cucumis melo L.) خالص درخربزه

1. توليد كارآمدگياهان هاپلوييد به منظور ايجاد لاين هاي(Cucumis melo L.) خالص درخربزه http://www.hortilover.net/

2. مقدمه در سالهاي اخير گياه خربزه مورد توجه بسياري از كشورها قرار گرفته و موسسات و شركت هاي اصلاح بذر تحقيقات وسيعي را جهت معرفي ارقام جديد با خصوصيات كيفي بالا، مقاوم به بيماريهاي مختلف و مناسب براي كشت دراقاليم گوناگون آغاز نموده اند . طي چند سال گذشته روش دابل هاپلوييدي به صورت موفقيت آميز و اميدبخشي براي تسريع برنامه هاي اصلاحي بعضي گياهان مهم زراعي بكار گرفته شده است . درحالي كه تلاش هاي انجام شده براي توليد گياهان هاپلوييد در خربزه و ساير انواع كدوييان از روش هاي معمول كشت بساك و تخمك موفقيتي درپي نداشت.

3. در سال ١٩٨٧ توليد اولين گياهان هاپلوييد درخربزه از طريق القاء جنين هاي پارتنوژنتيك با استفاده ازگرده هاي پرتوتابي شده توسط ساتون و همكاران گزارش گرديد. ولي عدم دسترسي به منبع پرتو گاما ، درصد پايين ،جنين-هاي القا شده، دشوار بودن تشخيص و نجات جنين هاي القاشده از طريق باز نمودن تعداد زيادي بذر، مشكلات دوبرابركردن كروموزوم ها و در نهايت تعداد كم لاين هاي به دست آمده ،استفاده از آن را در برنامه هاي اصلاح خربزه محدود مي نمود .

4. مواد و روشهاگياهان مادري خربزهايراني [(WCPM339 x ZCPM339)F5 x (HMX0583)] F هيبريد آ 1 [(WCPM339 x ZCPM339)F5 x (Galia A)] F هيبريد ب 1 مقاوم به ويروس هاي موزاييك هندوانه و موزاييك خيار و موزاييك زرد زوخيني، موزاييك خيار و سفيدك سطحي.

5. پرتودهي گرده و نجات جنين در سري اول گياهان مادري به روش معمول در مزرعه و در سري دوم به روش گلداني در داخل گلخانه كشت و با محلول هايغذايي تغذيه شدند . گلهاي نر درست در روز قبل از شكفتن(گلبرگ هاي سبز مايل به زرد ) جمع آوري و با دز ٢٥٠ واحدگري پرتو گاما(چشمه كبالت ٦٠) پرتودهيمي شدند . گل های ماده كه در صورت نياز از روز قبل براي جلوگيري از گرده افشانيناخواسته، اخته و ايزوله شده بود با استفاده از3-2گل نرپرتوتابي شده و يا در مواردي به عنوان شاهد با استفاده ازگلهاي نرسالم گرده افشاني ميشد.

7. ميوه هاي تشكيل شده ٢٣-٢١روز پس از گرده افشاني برداشت و تا زمان استفاده در دماي محيط نگهداري مي-شدند. بذرهاي موجود در آنها خارج گرديده روي كاغذهاي استريلتميز شده و يكي يكي جهت يافتن جنين ها با كمك ابزارجراحي باز مي شدند (شكل ٢).

8. شكل ٢-بازكردن تك تك بذرها جهت جستجو و استخراججنين هاي هاپلوييد القا شده

9. ابداع روش كشت مايع براي تشخيص جنينها در اين روش بذرها پس ازخارج شدن از ميوه و شستشو در محيط سترون بصورت شناوردر محيط كشت مايع ٢٠E قرار مي گرفتند ( ٩٠- ٨٠ بذر در هر ظرف پتري ٢٠× ١٠٠حاوي ٢٠ ميلي ليتر مايع ) و بر روي يك شيكر ملايم ( ٣٠ دور در دقيقه ) و زير نور كافي در اطاقك رشدنگهداري مي شدند . بعد از حدود ١٠ روز بذرهايي كه حاويجنين بودند بواسطه آنكه جنينهاي آنها رشد كردهو يا به رنگسبز گراييده و حتي در بعضي موارد ريشه چه آنها خارج شده بودبه راحتي قابل تشخيص بودند.

10. . بدين ترتيب اين جنينها خارجشده و طبق روش معمول بر روي محيط كشت جامد كشتمي شدند (شكل ٤و٥). شكل ٤-رويت جنين هاي نموشكل٥-كشت جنين هاي يافته در داخل بذر در محيط مايعهاپلوييد جوانه زده داخل بذر

11. رشد و تكثير گياهان به دست آمده جنين هايي كه خوب رشد مي كردند و گياهچه هاي كاملي راتشكيل مي دادند بطور جداگانه در ظروف كشت با ارتفاع ١٥-١٠ سانتيمتر و دربهاي شفاف منتقل مي شدند (شكل٣). شكل ٣- گياه حاصل از نمو جنين در محيط كشت، ٤ هفتهپس از كشت

12. سپس هر گياه بنام يك لاين نامگذاري و طي يك يا چند مرحلهاز طريق كشت جوانه انتهايي و ميانگره هاي آن در محيط كشتتازه تكثير مي شد (شكل ٦). گياهان به دست آمده به بسترهاي خاكي منتقل شدند و پس از مقاوم سازي تدريجي نسبت به هواي محيط, تحت تيمار كولشيسين قرارگرفتند. شكل ٦-تكثير گياه هاپلوييد در محيط كشت

13. تعيين سطح پلوييدي در مرحله اول از رنگ آميزي سلولهاي انتهاي ريشه بااستوكارمن و شمارش كروموزومي و در مرحله دوم از فناوريفلوسيتومتري براي حصول اطمينان از ها پلوييدي گياهانحاصله استفاده گرديد. دستگاه فلوسيتومتر منحني هايي برمبناي اندازه هسته سلولها رسم مي نمايد و مي توان از آن بااستفاده از يك گياه استاندارد كه حجم هسته آن مشخص ومحل پيك آن ثابت مي باشد به آساني براي تشخيص سطحپلوييدي گياهان نيز استفاده نمود. در اين آزمايش چند گياهمختلف كه حجم هسته اي نزديك به خربزه دارند ازجمله برنج،خيار و آرابيدوپسيس براي تعيين بهترين گياه استاندارد برايخربزه مورد آزمون قرار گرفتند.

14. كشت تخمدان به موازات روش نجات جنين ٦٢ تخمدان تلقيح نشده ازهيبريد آ ، ٦٠ تخمدان از هيبريد ب و ٤ تخمدان از خربزه ایرانی كشت گرديدند . گل هاي ماده در روزشكوفايي قبل از ظهر جمع آوري وبهآزمايشگاه منتقلمي شدند. سپس بصورت عرضي به ١٠-٦قطعه با قطر حدود يك ميلي متر برش داده شده و قطعات هر تخمدان در يك ظرف پتري ١٥ × ١٠٠ بر رويمحيط كشت حاوي املاح و ويتامينهاي پايه ام اس قرارداده شدند . تخمدانهاي كشت شده در اتاق رشدي مشابه با جنين هانگهداري شدند. درمواردي كه جنيني نمو يافته و قابل رويتبود از تخمدان جدا و در محيطاماس بدون هورمون كشتمي شد.

15. نتايج و بحثميوه ها، بذور و جنينهاي به دست آمده ٥٥% از گلهاي گرده افشاني شده با گرده هاي پرتوتابيشده در مرحله اول و ٨٥ % در مرحله دوم با شرايطي مشابهباگلهاي گرده افشاني شده با گرده هاي سالم تشكيل ميوه دادند .پايين بودن درصد ميوه هاي تشكيل شده در مرحله اول حاصلاز مشكلات گرده افشاني دستي در مزرعه مي باشد . در اينميوه ها پوسته بذر نيز بطور طبيعي توسعه يافته بود ولي اكثرآنها پوك بودند . درصد كمي از آن ها حاوي جنينهاي كوچكي بودند كه جزييات تعداد، نسبت و گياهان حاصل از آنها درجدول ١ آمده است.

16. جنين هاي به دست آمده در مراحل نموي مختلفيقرارداشتند. اگرچه بعضي جنين هاي نارستر (مرحله كروي ) و ياتوسعه يافته تر (لپه اي) نيز قابليت باززايي داشتند بهترين مرحلهبراي باززايي در محيط كشت مرحله قلبي شكل بود.جنين هايقهوه اي كه به نظر مي رسيد پيش از استخراج سقط شده باشندو جنين هاي اژدري شكل كه غيرطبيعي به نظر مي آمدند قابليتباززايي نداشتند .

18. اگرچه كشت گياهان مادري در مزرعه موفقيت آميز بود وبواسطه نزديكتر بودن به شرايط طبيعي كشت خربزه بوميمزيت هاي نسبي بر آن مرتبط مي باشد ولي به دليل پايين بودندرصد تشكيل ميوه حاصل از تلا قي دستي در مزرعه و احتمالانتقال بيماري هاي بذر زاد كه در مزرعه انتشار دارند بهجنين هاي حاصله قابل توصيه نمي باشد .

19. ارزيابي نتايج استفاده ازكشت مايع درسري دوم (جدول ٢)نسبت گياهان به دست آمده(٥/-٦/١ هاپلوييد در صد بذر ) از طريق بازكردن بذرها مطابقيافته هايپيشين بود ولي با كمك كشت مايع افزايش چشمگيري نشانداد (٩/٢-٨/ ٢ گياه هاپلوييد در صد بذر). اين روش مزاياي بسيار زيادي دارد و علاوه بر آنكه مستلزم دسترسي به دستگاهپرتونگار نمي باشد هزينه و خطر كمتري را نيز در پي دارد .

21. مزيتهاي روش جديد را مي توان به صورت ديگر بر مبناي تعدادبذر مورد نياز و تعداد بذري كه بايد براي به دست آوردن ١٠٠گياه هاپلوييد بازبيني شود بيان نمود (جدول ٣).

22. گلدهي در محيط درون شيشه اي در تعدادي از گياهان سري دوم ( ١٤ لاين از هيبريد آ و ١٧لاين از هيبريد ب ) پس از انتقال به ظروف كشت و يا در حين تكثير در محيط درون شيشه اي تعداد قابل توجهي گل هاي نرمشاهده گرديد كه بعضي از آنها بعد از مدتي شكفته مي شدند(شكل ٧). شكل ٧- توليد گل نر در برخي لاين ها در محيط درون شيشه اي

23. اين گلها همانگونه كه انتظار مي رفت كوچك و فاقد دانه گرده بودند . وقوع پديده گل انگيزي در تعداد محدودي ازلاين ها اگرچه ممكن است اندكي متاثر از تغييرات جزيي عوامل محيطي در اتا ق رشد بوده باشد ولي مي تواند بيانگر تفاوت ژنتيكي آنها در زودگلدهي باشد .

24. تاييد هاپلوييد بودن گياهان حاصله و مقايسه آنها با گياهانديپلوييد جنين هاي كوچك هاپلوييد به راحتي از جنين هاي كامل وبا لپه هاي توسعه يافته حاصل از لقاح مضاعف وگردهافشاني با گرده هاي سالم كه به عنوان شاهد انجام شده بود، قابل تشخيص بودند. اندامهاي رويشي گياهان حاصله در شرايط سني و رويشي مشابه كوچكتر از گياهان ديپلوييد بود .

25. در سري اول حتي زمانيكه طول بوته ها پس از انتقال به گلخانه به حدود يك متررسيده بود هيچگونه علائم ظهور گل به چشم نمي خورد . درسري دوم تقريبا تمام لاين ها پس از انتقال به گلدان و قرارگرفتن در شرايط گلخانه تعداد زيادي گل هاي نر و به تدريج تعدادي گل ماده ظاهر شد كه از لحاظ ظاهري كوچكتر بوده و بواسطه جدابودن گلبرگ ها از گل هاي پيوسته گلبرگ ديپلوييد متمايز بود ند. همچنين گل هاي نر آنها دانه گرده توليد نمي كردند وگل هاي ماده قادر به تلقيح و توليد ميوه نبودند(شكل ١٢).

26. شكل ١٢ -تفاوت اندازه و ريخت ظاهري گلها درگياهان هاپلوييد(سمت چپ) وديپلوييد (سمت راست)

27. به هر حال هر دوروش شمارش كروموزومي (شكل 10و١١ ) و تجزيه فلوسيتومتريك هسته هاي سلولي (شكل ١٣ )،هاپلوييد بودن گياهان حاصله را كاملا تاييد مي نمود. شكل ١٠ -تصوير ميكروسكوپي شكل ١١ -تصوير ميكروسكوپي كروموزوم هاي گياه هاپلوييد كروموزوم هاي گياه شاهد ديپلوييد

28. شكل ١٣ -تجزيه فلوسيتومتريك بافت برگ خربزه به همراه گياه استاندارد كلم بروكلي، سمت چپ: نمونه شاهد ديپلوييد خربزه، سمت راست: گياههاپلوييد حاصل از نمو جنين هاي پارتنوژنتيك

29. كشت تخمدان دركشت تخمدان هاي تلقيح نشده اگر چه در بسياري ازنمونه ها ٣-٢روز پس از كشت تعدادي از تخمكها اندكي نمويافته و قابل رويت بودند ولي پس از ٦ هفته انتظار هيچ گياهچه اي از مجموع ١٢٢ تخمدان كشت شده در هيبريد آ وب به دست نيامد . حدود ٤٠ % از تخمدانها مقدار قابل توجهي كالوس سبز از بافت هاي رويشي ديواره تخمدان توليد نمودند ومابقي بدون هيچگونه نموي به تدريج به رنگ خردلي گراييدند (شكل ٨).

30. شكل ٨-كشت تخمدان هاي تلقيح نشده، عدم توسعه(سمت چپ) و ياتوليد كالوس از بافت هاي رويشي ٦ هفته پس از كشت(سمت راست)

31. نتيجه گيري روش نجات جنين هاي القا شده بوسيله پرتو گاما روشي مطلوب براي توليد گياهان هاپلوييد در خربزه مي باشد و تمام گياهان به دست آمده در آن هاپلوييد هستند . 250واحد گري پرتودهي دز مناسبي براي القا هاپلوييدي و سه هفته پس از گرده افشاني زمان مناسبي براي نجات جنين ها ست. نسبت جنين و گياه به دست آمده در ژنوتيپ هاي مختلف متفاوت مي باشد ولي اغلب ارقام ايراني واكنش خوبي نسبت به اين روش نشان دادند .

32. بكارگيري كشت مايع بذورجهت تشخيص واستخراج جنينها كه براي اولين بار انجام شد تاثير بسيار زياد درافزايش كارآيي اين روش داشت بطوري كه توليد تعداد زيادي گياه هاپلوييد را با سهولت واطمينان بيشترميسرمي سازد . در صورت موفقيت در ديپلوييد كردن تعدادكافي از لاين-هاي به دست آمده بطور قطع استفاده ازگياهان دابل هاپلوييد براي دسترسي به لاين هاي خالص و تسريع برنامه هاي اصلاحي در خربزه مفيد و كارآمد خواهد بود .

33. اگرچه مراحل انجام كار در روش كشت تخمدان هاي تلقيح-نشده قدري آسانتر است ولي با توجه به اينكه نتيجه آن بشدت وابسته به ژنوتيپ مي باشد ، مراحل نمو گياهان بدست آمده بسياركند است و تنها درصدي از آنها هاپلوييد مي باشند به نظر مي رسد كارآيي كمي براي استفاده در برنامه هاي اصلاحي داشته باشد . همچنين مشخص شد كه استفاده از فناوري فلوسيتومتري بويژه زماني كه تعداد گياهان مورد بررسي زياد باشد روشي موثردر تعيين سريع و آسان سطح پلوييدي آنها مي-باشد.