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Pasantía en Rosario Diciembre 2007-Febrero 2008

Pasantía en Rosario Diciembre 2007-Febrero 2008. Presentación del Modelo. Trypanosoma cruzi y sus particularidades. Enferemdad de Chagas Varios millones de personas afectadas Agente causante: T. cruzi. gen A gen B gen C gen D gen E gen D .

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Pasantía en Rosario Diciembre 2007-Febrero 2008

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Presentation Transcript

  1. Pasantía en RosarioDiciembre 2007-Febrero 2008

  2. Presentación del Modelo Trypanosomacruziy sus particularidades

  3. Enferemdad de Chagas • Varios millones de personas afectadas • Agente causante: T. cruzi

  4. gen A gen B gen C gen D gen E gen D ADN ARN policistronico Trans-splicing Poli adenilación ARNm individual AAAAA Estabilidad del Mensaje - Movilización AAAAA … AAAAA Transcription Traducción Modificaciones AAAAA Expresión génica

  5. Importancia de la regulación post-transcripcional • Estabilidad • Traducción • Cambios rápidos en la expresión génica • Proteínas de unión al ARN (UTR’s) • Familia Pumilio • Drosophila • Estabilidad y traducción • Dominio conservado de interacción • Estudios en levadura • 10 miembros en T. cruzi • TcPuf6

  6. Antecedentes de la pasantía

  7. TcPuf6 • No esencial para el crecimiento • Sobreexpresión en T. bruceireduce infectividad • Expresión constitutiva

  8. Mensajeros asociados a TcPuf6

  9. Interacción entre TcPUF-6 y TcDdh1

  10. Objetivos

  11. Demostrar la unión de la proteína homologa a Pop2 en T. cruzia TcPuf6 por medio de ensayos de Y2H • Clonar (y expresar) dicha proteína para continuar con su caracterización

  12. Procedimiento experimental

  13. Doble híbrido en levadura

  14. Resultados

  15. Doble híbrido en levadura pEntr-pop2 pEntr-puf6 Clonasa pGad-pop2 pGbk-pop2 pGad-puf6 pGbk-puf6

  16. Cotransfecciones relevantes Cotransfección de ambas fusiones • Para ver interacción: • pGad-pop2/pGbk-puf6 • pGad-puf6/pGbk-pop2 • Controles de auto-activación por pop2: • pGbk-pop2/pGad-T7 • pGad-pop2/pGbk-T7 • Controles de auto-activación por puf6: • pGbk-puf62/pGad-T7 • pGad-puf6/pGbk-T7 • Control negativo • pGad-T7/pGbk-T7 Cotransfección con un vector vacío Cotransfección con ambos vectores vacios

  17. MasterPlates (-LT)

  18. Controles autoactivaciónpGBK -LT -ura -his 50mM 3AT

  19. Placas –LT –H 3AT pGBK-Puf/pGAD-pop

  20. Placas –LT –Ura pGBK-Puf/pGAD-pop

  21. Método de las diluciones –LT –Ura –LT –His 50mM3AT -LT ContGad Cont - ContGbk Gbk-pop/ Gad-puf

  22. Producción de proteína recombinante en E. coli pEntr-pop2 Clonasa pDest-pop2 pGex-pop2

  23. Inducción con 1mM IPTG S/indHisGst MW Pop-gst??

  24. Concluisones • Se logro clonar TcPop2 • Existe una interacción entre TcPuf6 y TcPop2 en este sistema • Podríamos tener un sistema de sobreexpresión de TcPop2-Gst para continuar con la caracterización del sistema

  25. Cosas pendientes • Controles… • Purificar TcPop2 • Validar en un segundo sistema la interacción encontrada (Anticuerpo)

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