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Tema 12: Genómica

Tema 12: Genómica. Griffiths AJ et al., (2000) Klug WS y Cummings MR (2006) Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources http://www.genome.iastate.edu/resources/other.html. Inma Martín-Burriel: minma@unizar.es. Contenidos. Introducción Genómica estructural

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Tema 12: Genómica

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Presentation Transcript

  1. Tema 12: Genómica Griffiths AJ et al., (2000) Klug WS y Cummings MR (2006) Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources http://www.genome.iastate.edu/resources/other.html Inma Martín-Burriel: minma@unizar.es

  2. Contenidos • Introducción • Genómica estructural • Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio • Aplicaciones de los polimorfismos • Genómica funcional

  3. Definiciones • Genómica es el conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral del funcionamiento, el contenido, la evolución y el origen de los genomas. Es una de las áreas más vanguardistas de la Biología. La genómica usa conocimientos derivados de distintas ciencias como son: biología molecular, bioquímica, informática, estadística, matemáticas, física, etc. • Genomics is a discipline in genetics concerning the study of the genomes of organisms. The field includes intensive efforts to determine the entire DNA sequence of organisms and fine-scale genetic mapping efforts. The field also includes studies of intragenomic phenomena such as heterosis, epistasis, pleiotropy and other interactions between loci and alleles within the genome.

  4. Historia de la Genómica • 1977: Secuenciación completa del genoma de 5.400 nt del virus ØX174 (Sanger et al.) • Desarrollo de métodos de secuenciación: secuencia de genomas eucarióticos.

  5. 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert Métodos de terminación de la cadena o método de Sanger Pirosecuenciación Secuenciación a gran escala (NGS)

  6. GENÓMICA Estructural Funcional Secuencia descubrimiento genes, localización Función de los genes Regulación Comparativa Compara genomas de diversas especies para elucidar las relaciones funcionales y evolutivas. Desarrollo de organismos modelo de enfermedades

  7. ESTRUCTURAL: Caracterización de la naturaleza física de genomas completos FUNCIONAL: Caracterización del proteoma y de los patrones globales de expresión génica Genómica Caracterización molecular de genomas completos

  8. DNA eucariótico Genes funcionales de copia única DNA de secuencia repetida DNA separador Secuencias funcionales Secuencias sin función conocida Secuencias funcionales No codificantes Repeticiones heterocromatina Del centrómero Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados) VNTR Familias de genes dispersos Secuencias derivadas De transposiciones Familias de genes en tándem Transposones Retrotransposones Genómica estructural Clasificación del DNA eucariota Caracterización de la naturaleza física de genomas: - Polimorfismos del DNA - Cartografía

  9. Polimorfismo genético Polimorfismo: Variante genética que aparece en la población con una frecuencia > 1% • Polimorfismo bioquímico: • Detección de variación al nivel del producto del gen: proteínas, enzimas • Polimorfismos del DNA: • Variaciones presentes en la secuencia de bases • Polimorfismos producidos por mutaciones puntuales • Polimorfismos del número de repeticiones en tándem http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/P/Polymorphisms.html http://www.chinaphar.com/1671-4083/25/986.htm http://www.systemsbiology.org/technology/data_generation/Microsatellite

  10. Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem

  11. Alelo 1 CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA Alelo 2 Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem • DNA microsatélite (STR): • Short Tandem Repeat • Pequeñas formaciones (generalmente < 150pb) de repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos) • Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10) • Herencia mendeliana codominante

  12. Genotipado: Secuenciación: ACGT • Visualización de los microsatélites

  13. Implicaciones de las secuencias microsatélites en patologías: • Expansión de microsatélites de trinucleótidos: • Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n • Distrofia miotónica (DM) (CTG)n • Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n • Ataxia de Friedreich (FA) • Nueve formas de ataxia espinocerebelar (SCA) • Expansión de tetranucleótidos: DM2 • Expansión de pentanucleótidos: SCA10 Enfermedades humanas se han creado animales modelo

  14. Secuencias de DNA dispersas • ¿DNA basura? ¿DNA egoista? • - ¿Regulación de la expresión? • ¿Puntos de recombinación? • Control de la segregación de cromosomas (centrómeros) • Estabilización de los cromosomas en la replicación (telómeros)

  15. ENCODE: Encyclopedia of DNA Elements: • Proteinor non-coding RNA • Proteinbinding • Specificchromosomestructure

  16. TACGAGCTA TACGGGCTA Alelo 1 Alelo 2 Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales • Variación de un nucleótido en una posición determinada. • Frecuencia:1/1000pb • También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) • Cambios de bases: • Transiciones: • Purina Purina: • Pirimidina Pirimidina: • Transversiones • PurinaPirimidina: • Pirimidina Purina A G Purinas T C Pirimidinas

  17. SNP: Single Nucleotide Polymorphisms: • Polimorfismo muy frecuente (1/300 pb) • 10 a 30 millones de SNP en el genoma humano • Dos posibles alternativas en cada individuo • Herencia es muy estable (baja tasa de mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites) • Fácil estandarización • Aplicaciones en la determinación de enfermedades y en farmacogenética

  18. Detección de los SNP: RFLP: Southern Blot PCR + RFLP Secuenciación Minisecuenciación Sondas específicas SSCPs PCR en tiempo real… RFLPs Detección mediante enzimas de restricción: Southern Blot PCR+RFLP Normalmente determinados en exones RFLPs-SNP • Origen: mutaciones puntuales • Variabilidad: 2 alelos • Localización: exones, intrones, regiones reguladoras, DNA espaciador

  19. RFLP: Aat II TGGACGTCT TGGATGTCT Alelo 1 Alelo 2 Detección de mutaciones puntuales Sonda Alelo 1 Alelo 2 MCL1

  20. Detección de mutaciones puntuales Minisequencing

  21. Marcador del DNA (genético) • Gen o secuencia de DNA cuya localización en el genoma se conoce. • Características: • Tienen que ser polimórficos (en la población). • Si es un gen no interesa la función sino las variaciones en el DNA (que pueden reflejarse en diferencias funcionales) (ej. Grupo sanguíneo). HAY POCOS GENES MARCADORES. • Las variaciones en un segmento de DNA se transmiten según las reglas Mendelianas de codominancia. HAY MUCHAS SECUENCIAS MARCADORES.

  22. Tipos de marcadores • SNP (or Single nucleotide polymorphism) • RFLP (or Restriction fragment length polymorphism) • RAD markers (or Restriction site associated DNA markers) • AFLP (or Amplified fragment length polymorphism) • VNTR (or Variable number tandem repeat) • Microsatellite polymorphism, SSR (or Simple sequence repeat) • STR (or Short tandem repeat) • SSLP (or Simple sequence length polymorphism) • RAPD (or Random amplification of polymorphic DNA) • SFP (or Single feature polymorphism) • DArT (or Diversity Arrays Technology)

  23. Aplicaciones de los polimorfismos del DNA: • Diagnóstico genético • Identificación individual • Construcción de los mapas génicos • Ligamiento con fenotipos

  24. Diagnóstico genético indirecto: Análisis de marcadores genéticos X Gen alterado Mutación puntual Microsatélite RFLP Deleción Inserción Marcador polimórfico Genotipo del marcador  Genotipo del gen dañado

  25. Identificación individual: • Marcadores fenotípicos (HLA, Gr. Sanguíneos) • Análisis de marcadores microsatélites • PCR, secuenciación • Fingerprinting (minisat.) Microsatélites Minisatélites Control de filiación Control de libros genalógicos Detección mediante RFLP + Southern

  26. Mapas del genoma: • Mapa genético • Posiciones relativas de los genes entre si, sin anclaje físico • Distancia entre marcadores determinada por la frecuencia de recombinación en la meiosis • Mapa físico • Posición exacta de un gen • Distancia entre marcadores determinada por nº de pb

  27. Secuenciación de genomas Construcción de librerías PCR en puente Secuenciación por síntesis

  28. Análisis bioinformático (NGS) • Preprocesado de las secuencias • Control de calidad • Alineamiento de secuencias: formación de contigs • Alineamiento con las referencias • Búsqueda de variantes

  29. Ligamiento: Identificación de regiones del genoma con un nº de alelos compartidos en individuos afectados > al esperado (en familias) Análisis de 500 pols Regiones candidatas y acotamiento de la región Alelos raros de alto riesgo Asociación: Análisis de individuos afectados no emparentados e identificación de alelos compartidos Facilidad para la obtención de muestras Necesidad de analizar miles de marcadores Alelos de acción modesta en enfermedades comunes Ligamiento con fenotipos

  30. Secuenciación del Exoma • Alineamiento con secuencias de referencia • Eliminación de variantes comunes (dbSNP, HapMap8) • Secuenciando 3 o 4 individuos mutación causante • Riesgo de falsos negativos • Estudio de ligamiento + NGS (secuenciando familia e identificando los fragmentos cromosómicos heredados de los padres) • Confirmación con pruebas bioquímicas y funcionales

  31. Genómica funcional • Los datos de la secuenciación a gran escala son el punto de partida de la genómica funcional • Búsqueda de ORF en secuencias de DNA desconocidas • Identificación de su función • Empleo de chips (microarrays) de DNA para estudio de regulación génica

  32. Chips de DNA • Muestras de DNA ordenadas, unidas a un chip de cristal del tamaño de un cubreobjetos • En un chip puede haber miles de muestras (cDNA de genes conocidos) • Los chips se exponen a muestras de mRNA marcados procedentes de distintos tejidos (distinta fase de desarrollo, tumoral vs normal, etc.) • Se miden variaciones en la expresión de los tejidos

  33. RNAseq Algorithm overview, for paired-end RNA-Seq. Lee S et al. Nucl. Acids Res. 2010;nar.gkq1015 © The Author(s) 2010. Published by Oxford University Press.

  34. Aplicaciones de la Genómica • Conocimiento y comprensión de procesos patológicos • Precisión de diagnóstico: • Clasificación más fina (cáncer de colon, piel) • “Farmacogenómica”  respuesta individual a tratamientos, elección de quimioterapia • Evaluación correcta del riesgo genético: • Predicción de la agresividad tumoral • Prevención conocido el riesgo genético • Comenzar planes de vigilancia en riesgo de cáncer, hipercolesterolemia, hemocromatosis,..

  35. Implicaciones del conocimiento del genoma • Análisis de recién nacidos • Detección de portadores • Desarrollo de terapias: • Terapia génica: reemplazar un gen alterado por el gen funcional • Terapia basada en la genética: • Diseño de nuevas drogas • Tratamientos basados en las bases moleculares • Elección del tratamiento • Identificación de genes con interés en producción.

  36. Microarray: Videos de genómica http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM http://www.youtube.com/watch?v=ePFE7yg7LvM&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=AhnTT6-Jgcg&feature=related Exon Sequencing http://www.youtube.com/watch?v=ZY_vPbpPnrc&sns=em

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