Enzimoloģija/Metabolisms 1. Lekcijas saturs: Biokatalīzes mehānismi. Kinētikas elementi.

1. Enzimoloģija/Metabolisms 1. Lekcijas saturs: Biokatalīzes mehānismi. Kinētikas elementi. Molekulāras bioloģijas (bioķīmijas)katedra 2009/2010. akad.gads

2. Biokatalīzes mehānismi • Skābju-bāzu katalīze (Acid-base catalysis) • Kovalentā katalīze , tās nukleofīlās un elektrofīlās fāzes (Covalent catalysis) • Metāla jonu katalīze (Metal ion catalysis) • Elektrostatiskā katalīze ( Eletrostatic catalysis) • Katalīze caur tuvināšanos un orientāciju (Catalysis through proximity and orientation) • Katalīze caur priekšrocībām pārejas stāvoklī (Preferential binding of the transition state complex )

3. Biokatalīzes mehānismi • Skābju-bāzu katalīze (acid-base catalysis) - ribonukleāze

5. Biokatalīzes mehānismi 2.Kovalentā katalīze , tās nukleofīlās un elektrofīlās fāzes (covalent catalysis)

8. Biokatalīzes mehānismi 3. Metāla jonu katalīze (metal ion catalysis) –kaboksipeptidāze. Elektrofīlais Zn2+ polarizē karbonīlgrupas skābekli un peptīdsaite atslābst

9. Biokatalīzes mehānismi 4. Elektrostatiskā katalīze ( eletrostatic catalysis) – superoksīddismutāze 2O2.- + 2 H+ = H 2O 2 + O2 “+” “-”

10. Biokatalīzes mehānismi 5. Heksokināzes piemērā labi redzama katalīze caur tuvināšanos un orientāciju

11. Kinētikas elementi Pētot reakcijas (sākuma) ātruma atkarību no substrāta koncentrācijas iegūst raksturīgu līkni, kurā svarīgi trīs momenti: 1.no sākuma paaugstinot substrāta koncentrāciju reakcijas ātrums pieaug, bet vēlāk iestājas piesātinājums un reakcija iet ar maksimālo ātrumu V max 2.substrāta koncentrācija, pie kuras šis piesātinājums iestājas ir atšķirīgs – reakcijas raksturojas ar dažādiem V max 3.dažādās enzimātiskās reakcijās līknes stāvums ir atšķirīgs. Tas atkarājas no enzīma un substrāta dabas – to tieksmes saistīties enzīma substrāta kompleksā Līknes raksturu var izteikt matemātiski , ieviešot noteiktas konstantes

12. Konstanšu un vienādojumu izvedumiem izmanto klasisko enzimātiskās reakcijas vienādojumu: E + S  ES  E + P 1. Tātad, šeit var notikt četras reakcijas , kuru ātrumi ir: v +1 = k+1 x [E] x [S] - tas ir enzīma substrāta kompleksa veidošanās ātrums, kurš atkarīgs no reaģējošo vielu t.i. E un S koncentrācijas un reakcijas ātruma konstantes. v -1= k-1 x [ES] - enzīma substrāta kompleksa disociācijas ātrumsatpakaļ par enzīmu unsubstrātu. v+2= k+2 x [ES] – enzīma substrāta kompleksa disociācijas ātrumspar enzīmu un produktu. v -2= k-2 x [E] x [P] – enzīma un produkta atkal asociācijas ātrums par enzīma substrāta kompleksu. Izrādās, ka šī reakcija praktiski nenotiek,tādēļ to tālākos aprēķinos ignorē. Līdzsvara stāvoklī, kad reakcija iet ar maksimālo ātrumu: v +1 = v–1 + v+2 2. izmantojot reakciju ātruma vienādojumu labās puses , iegūst izteiksmi: k+1 x [E] x [S] = k-1 x [ES] + k+2 x [ES], 3. k+1 /k-1+ k+2 = [ES] / [E] x [S] no tās var izvest enzīma substrāta veidošanās, asociācijas konstanti: k+1 / k-1+ k+2 = Keq 4. Apgrieztais lielums asociācijas konstantei ir 1/ Keq = , un to sauc par Mihaelisa konstanti, tā ir enzīma substrāta kompleksa disociācijas konstante. Tā atspoguļo enzīma un substrāta dabu, to tieksmi saistīties kompleksā. Mazi konstantes lielumi atspoguļo augstu saistīšanās tieksmi un otrādi. Tātad, Mihaelisa konstantes matemātiskā (ne skaitliskā !) izteiksme ir: Km = k-1+ k+2 /k+1 5.

13. Tātad, Mihaelisa konstantes izteiksme ir: k-1+ k+2 [E] . [S] Km = , bet no vienādojuma 3. arī Km =6. k+1 [ES] Zinot šo konstanti , kas atspoguļo enzīma substrāta dabu , respektīvi enzimātiskās reakcijas attēlotās līknes stāvumu, var izvest matemātisko sakarību starp substrāta koncentrāciju un enzimātiskās reakcijas ātrumu: Vmax . [S] V =7. Km + [S] Šis ir Mihaelisa-Mentenas vienādojums Briggsa Holdeina pārveidojumā un tas ir svarīgākais enzīmu kinētikas vienādojums, kurš ļauj raksturot enzīma un substrāta dabu, enzīmu specifiskumu, pētīt inhibītoru un aktivātoru ietekmi, noteikt maksimālo reakcijas ātrumu, substrāta koncentrācijas ietekmi uz reakcijas sākuma ātrumu.

14. Matemātiskā sakarība starp substrāta koncentrāciju un enzimātiskās reakcijas ātrumu (Izvedums pēc D.Meclera) : Uzdevums: noskaidrot sakarību V ? [S] K+1 K+2 Risinājums: pēc vienādojuma E + S  ES  E + P 1. K-1 maksimālais reakcijas ātrums Vmax =k+2 . [ES] ir tad , ja viss enzīms saistījies enzīma substrāta kompleksā resp. [ES] = [Etotālais ](Et) No tā izriet, ka V/V max = [ES]/[Et](svarīgākais slēdziens8. tālākiem pārveidojumiem) Savukārt,[Et ]= [E] + [ES] , jeb [E] = [Et –ES]un ievietojot izteiksmi [E] = [Et –ES] vienādojumā 6. iegūstam: [Et – ES]. [S] Km= [ES] , kuru atrisina, lai izteiktu ES/Etattiecību [Et].[S] – [ES].[S] Km= ; Km .[ES]=[Et].[S] – [ES].[S] ; Km.[ES]+[ES].[S]=[Et].[S]; [ES] [ES].(Km + [S]) = [Et].[S]; [ES]/[Et] = [S]/Km + [S] , kuru ievietojot 8. izteiksmē iegūstam: Vmax . [S] V/Vmax= [S]/Km +[S], resp. V= 7. Km + [S]

15. 1 Km 1 = + V Vmax x [S] Vmax Lainvivera-Berka vienādojums un tā grafiskais attēls

16. Mihaēlisa konstante: • Uzlūkojama kā enzīma substrāta disociācijas konstante • Atspoguļo enzīma un substrāta dabu, to tieksmi saistīties • enzīma substrāta kompleksā, pie kam zemi konstantes • lielumi atspoguļo augstu saistīšanās tieksmi un otrādi • Skaitliski Mihaēlisa konstante ir vienāda ar substrāta • koncentrāciju, pie kuras reakcijas ātrums ir puse no maksimālā • 4. Mihaēlisa konstantes izteiksmes forma (mērvienība) ir moli/litrā