CAT opsporen van parasieten in faeces: wat en voor wie?

1. CATopsporen van parasieten in faeces: wat en voor wie? Kristien Van Vaerenbergh 21 januari 2005 Supervisor: Prof. Dr. K. Lagrou Search verified by Dr. J. Frans

2. Parasieten in faeces • Voor wie is deze analyse van toepassing? • Optimale voorwaarden voor parasieten onderzoek in faeces • Beschikbare methoden • Wat kan er concreet aangeboden worden? -2004 -toekomst

3. IDSA richtlijnen: Management of Infectious Diarrhea (2001) • Steeds breder wordend arsenaal van pathogenen met toegenomen diagnostische mogelijkheden • Evaluatie en management van infectieuse diarree moet kosten-efficiënt zijn

4. IDSA richtlijnen: Management of Infectious Diarrhea (2001)

5. Voor wie van toepassing?

6. Voor wie van toepassing? Selectieve aanpak van diarree: Community-acquired diarree Reizigersdiarree Hospital-acquired diarree Persisterende diarree (> 7 dagen) zeker indien immuungecompromitteerd

7. Voor wie van toepassing? • De meeste episodes van acute ‘community-acquired’ diarree viraal / zelflimiterend / van korte duur : microbiologisch onderzoek binnen de 24 uur na aanvang zelden van toepassing

8. Voor wie van toepassing? • Reizigersdiarree: risico is sterk afhankelijk van reisbestemming • Meestal: acuut probleem, vaak bacterieel

9. Voor wie van toepassing? • Chronische reizigersdiarree: langer dan twee weken bij 10% van de reizigers – parasieten wel belangrijk

10. Voor wie van toepassing? • acute ‘community-acquired’ diarree en acute reizigersdiarree: • - indien faeces onderzoek: faeces cultuur, evt EHEC • - C. difficile kan van toepassing zijn

11. Nosocomiale diarree • Tijdens de eerste 3 dagen van hospitalisatie ~ ‘community-acquired diarrhea’ • Vaak niet-infectieus: tgv medicatie, parenterale voeding • Ontstaan na de eerste 3 dagen van hospitalisatie: C. difficile uitsluiten • Parasieten onderzoek en klassieke faeces cultuur uitermate lage opbrengst bij patiënten die diarree ontwikkelen na de eerste 3 hospitalisatiedagen, ook in pediatrische populaties • Kan wel bij verdere investigatie van ‘community-acquired’ diarree

12. Persisterende diarree Uitsluiten van parasieten, zeker indien immuungecompromitteerd: • Giardia • Cryptosporidium • Entamoeba histolytica • Cyclospora • Isospora belli Bijkomend bij HIV: Microsporidia Bijkomend bij TX-kandidaten: Strongyloides stercoralis uitsluiten

13. Persisterende diarree - HIV • Vóór de periode van HAART: diarree frequente complicatie van HIV-infectie; chronische diarree verantwoordelijk voor 17 % nieuwe AIDS-diagnoses bij CDC • Dankzij HAART: dramatische afname van incidentie van diarree (cfr andere opportunistische infecties) • Conservatieve houding immunologisch herstel vaak genezing chronische diarree; herval bij falen R/ • Diarree bij HIV vaak infectieus van oorzaak: virulente kiemen bij intacte afweer/ immuundeficiëntie; ook minder virulente kiemen bij gevorderde HIV/AIDS

14. Persisterende diarree - HIV Up to date

15. Persisterende diarree - HIV Oldfield E., Reviews in gastroenterological disorders, 2002.

16. Microsporidia • Opportunistische pathogeen • HIV: belangrijke verwekker van chronische diarree bij CD4 < 100/ul • Ook bij TX, reizigers, ouderlingen • Obligate intracellulaire sporenvormer; Vooral Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon species; resistente sporen • Wereldwijd voorkomen

17. Microsporidia • Transmissie: feco-oraal, evt via urine; minimum aantal sporen nodig? • S: vooral gastro-intestinaal, ook genito-urinair, respiratoir, gedissemineerd • D: sporen zeer klein (1-2 um) geen effectieve concentratietechnieken; gemodifieerde trichroomkleuring, fluorescentie technieken (FungiFluor, Calcofluor white); gouden standaard electronenmicroscopie; sensitiviteit van gemod. Trichroom en Calcofluor tov EM 100%, specificiteit ongeveer 80%. • R/ Immunologisch herstel belangrijk voor genezing, naast chronische, antiparasitaire therapie (albendazole voor Encephalitozoon infecties)

18. Microsporidia • Spore injecteert infectieuse sporoplasma in gastheercel via polaire filament • multiplicatie via ‘binary/multiple fission’ • maturatie van sporen Spore in faeces zeer klein (1-2 um)

19. Microsporidia • Chromotroop 2R kleuring: • zwarte pijl: E. bieneusi sporen • gele pijl: gevacuoliseerde spore • rode pijl: gist CDC

20. Cryptosporidium - Isospora belli - Cyclospora • Cryptosporidium parvum : • samen met Giardia belangrijke parasitaire darmpathogeen • klinisch beeld variabel, vooral waterige diarree (zelflimiterend indien immuuncompetent, tot chronisch bij AIDS) • vaak jonge kinderen • feco-oraal; via gecontamineerd water of voedsel • D/ oöcyste 3-4 um: gemodif. zuurvaste kleuring/ auramine/ safranine/ antigendetectie • R/ immuunreconstitutie

21. Cryptosporidium - Isospora belli - Cyclospora • Cyclospora cayetanensis: • Was vroeger al opgemerkt in faeces ‘blauw-groene algen’ • wereldwijd voorkomen • diarree bij reizigers, bij AIDS - patiënten, food - borne outbreaks • Zelflimiterende tot aanslepende diarree; AIDS cfr Cryptosporidium en Isospora • D/ gemodifieerde zuurvaste kleuring • autofluorescentie, safranine • R/ SXT Niet gekleurd - M. Lontie

22. Cryptosporidium - Isospora belli - Cyclospora • Cyclospora cayetanensis: • oöcysten 8 tot 10 um • oöcysten hebben enkele dagen • nodig na excretie voor ze infectieus zijn (ontwikkeling van gesporuleerde oöcysten)

23. Cryptosporidium - Isospora belli- Cyclospora • Isospora belli: • minst frequente van de drie • wereldwijd voorkomen, outbreaks gerapporteerd • vooral bij immuungedeprimeerden • AIDS: aanslepende waterige diarree, wasting cfr Cryptosporidium • kinderen: ernstige diarree • R/ immuunreconstitutie; SXT

24. Cryptosporidium - Isospora belli- Cyclospora Isospora belli: typische, ellipsoïdale oöcyste, groot (25-30 um)

25. . A, C en E: gemodifieerde zuurvaste kleuring . B, D en G: bright field microscopy . E, H: UV flurescentie – autofluorescentie (Cryptosporidium niet)

26. Strongyloides stercoralis • Moet altijd uitgesloten worden bij Tx-kandidaten, indien verblijf in endemische regio in voorgeschiedenis • Endemische regio: ZO-Azië, Latijns-Amerika, zuidoostelijke staten VS, ook Turkije en Noord-Italië • Chronische infectie: - onopvallend - GI, pulmonale, cutane S, eosinofilie - symptomen kunnen jaren persisteren • Diagnose: - detectie larven in faeces (rechtstreeks, na concentratie) : na 3 stalen sensitiviteit 50% - Baermann concentratie, cultuur: zz in routine - serologie: sensitiviteit en specificiteit > 90 % - microscopische detectie en serologie zijn complementair

27. Strongyloides stercoralis: rhabditoid larva (unstained). M.Lontie

28. Strongyloides stercoralis

29. Strongyloides stercoralis

30. Strongyloides stercoralis • autoinfectie: penetratie van perianale huid of colonmucosa door rhabditiforme larven, wat kan leiden tot hyperinfectie en gedissemineerde ziekte (bacteriëmie, meningitis – zeer hoge mortaliteit) • Immuunsuppressie (ook corticosteroiden) risicofactor voor hyperinfectie ! Alvorens te starten Strongyloides uitsluiten • ook van belang bij HIV- en HTLV-infectie • therapie: thiabendazole, ivermectin

31. Dientamoeba fragilis • Behoort tot flagellaten (“the unflagellated human flagellate “); nog geen cystevorm gekend • Trofozoiet: fragiel, 1 of 2 kernen met 4-6 granules, 5-15 um • Wereldwijd voorkomen • Diagnose: fixatie en permanente kleuring, zoniet geen detectie van fragiele trofozoiet; intermittente aanwezigheid; vaak miskend • Transmissie ? Vaak samen aanwezig met Enterobius vermicularis • Pathogeniciteit lang betwijfeld; incubatieperiode? Proportie asymptomatische infecties?

32. Dientamoeba fragilis • Symptomen: abdominale pijn (kan persisteren gedurende jaren), diarree, anorexie, moeheid, nausea, vermagering; regressie van S na therapie • Infecties bij kinderen frequent: -vaak milde infecties: seroposotiviteit 91% bij gezonde, Canadese kinderen (Chan et al, 1996) - vaker symptomatisch dan bij volwassene - eosinofilie • Therapie: Paromomycine, tetracycline, metronidazole

33. Dientamoeba fragilis

34. Dientamoeba fragilis • geen cyste vorm gekend, trofozoiet 1 of 2 kernen, 5-15 um, polymorf • fixatie en permanente kleuring (ijzer-hematoxiline; trichroom) • DD Endolimax nana, E. hartmanni

35. Optimale voorwaarden opzoeken parasieten in faeces • Collectietijden en aantal stalen: 3 stalen over een perioden van 7 tot 10 dagen owv intermittente aanwezigheid en variabele #; Geen collectie van meerdere stalen op dezelfde dag • Tijdsframe: verse preparaten voor beweeglijke protozoa: kans het grootst in vloeibare stalen, bekijken binnen het half uur na produktie! Zoniet, fixeer- middel gebruiken. Koelkast: vertraagt deterioratie

36. Optimale voorwaarden opzoeken parasieten in faeces • Interferende substanties mbt detectie: 7 dagen wachten na gebruik van AB, barium, antimalaria middelen, minerale olie… • Staalcollectie: goed sluitende container; minimaal enkele grammen faeces, om uitdroging te voorkomen • ‘3-day-rule’: Faeces cultuur en parasieten extreem lage opbrengst, zo diarree ontstaan is na 3 dagen hospitalisatie, ook bij pediatrische populaties. In deze setting C. difficile opsporen. Overleg labo-kliniek zeer belangrijk in opstellen van ‘rejectiecriteria’: veilige grens van 5 dagen / ‘modified 3-day-rule’

37. Beschikbare methoden intestinale parasieten • Macroscopische inspectie: consistentie, bloed, slijm… • Microscopisch onderzoek: cysten en trofozoieten van amoeben, flagellaten en coccidia, wormeneieren en larven - de grootte (te meten met een micrometer) - het aspect van de kern - randen - RO verse faeces: opsporen trofozoieten (lage gevoeligheid; tijd !) - Concentratiemethoden: globale methoden: - flotatie (hoog SG: suiker, zinksulfaat) - sedimentatie (formaline-ether en derivaten laag SG) voordelen sedimentatie: minder technische fouten, eenvoudiger, grootste range detecteerbare organismen

38. Soortelijk gewicht • S.G. of Zn-sulfate 33 %: 1.180 • S.G. of formol-solution 10 %: 1.019 • S.G. of ether: 0.714 • S.G.of parasites: Ancylostoma 1.055; Giardia 1.060; Entamoebahistolytica (coli) and Endolimaxnana 1.065 - 1.070; Ascaris 1.110; Trichuris 1.150, Chilomastixmesnili 1.180; Ascaris (unfertilized) 1.200 (Bailenger, 1965). M. Lontie

39. Microscopisch onderzoek: • VS, Nederland : faeces in fixeermiddel (SAF, formaline, PVA…) permanente kleuring (trichroom, chromotrope kl…) Pro: - geschikt voor trofozoieten en cysten - herbekijken, expert advies mogelijk Contra: - expertise nodig • EIA, DFA: monoclonale antistoffen tegen welbepaald species (Giardia, Cryptosporidium, Entamoeba histolytica) • Pro: - verhoogde sensitiviteit, specificiteit en tijdswinst • EIA giardiasis bijna even gevoelig als microscopie op 2 opeenvolgende stalen (Mank, 1997) • Contra: -duur • PCR: identificatie van Entamoeba species, detectie en identificatie Microsporidia – Blessmann (2002) E. histolytica real time PCR: significant gevoeliger dan microscopie, 100% specifiek

40. Triple Faeces Test (TFT) van Gool, 2003. • 544 patiënten, 85% exacte inlevering • 72% SAF preparaten: enkel met lugol • conventionele methode: 22.9 % + • TFT: 45.2 % + • Intermittente shedding • voordeel tgv - betere compliance • - fixatief • - permanente kleuring • acceptabele meerkost

41. Triple Faeces Test (TFT) van Gool, 2003. Tabel van gool

42. ‘Faeces parasieten’ in de praktijk: 2004 • Microbiologisch faeces onderzoek: cultuur, C. difficile (cultuur en toxine), opsporen van parasieten; ook virologie • ‘parasieten faeces’: - macroscopisch nazicht - microscopisch onderzoek na Ritchie-concentratie - auramine/safraninekleuring op vraag of bij MO verdacht voor Cryptosporidium • Kostprijs voor labo ‘faeces parasieten’ 7.44 euro ‘Cryptosporidiumkleuring’ 8.40 euro • In 2004 ‘parasieten faeces’ 1778 uitgevoerd; dalende trend tov vorige jaren (2327 in 2001 en 2002, 2111 in 2003)

43. Aanvragers van ‘faeces parasieten’ in 2004 • vanaf 8 aanvragen / jaar weerhouden • Grote aanvragers: E409 (29%), E302 (9.5%) en E595 (8%).

44. In 2004 werd 1778 keer ‘parasieten in faeces’ uitgevoerd. Aanvragen per maand variëren tussen 125 en 183. Hoogste opbrengst in maanden april-juli (6.5-8.2%).

45. In 2004 werden 106 parasieten gedetecteerd, 86/1778 stalen waren positief (4.8%). Positieve stalen waren afkomstig van 67 patiënten. • 36 parasieten evt pathogeen (E. dispar/histolytica) Gedetecteerde parasieten in 2004

46. Omgerekend naar patiënten: Giardia lamblia (18), Entamoeba histolytica/dispar (6), Taenia (2) en Cryptosporidium (1). • In 2004 werden 1778 ‘parasieten faeces’ uitgevoerd, voor 27 patiënten werd een pathogene parasiet gedetecteerd. Gedetecteerde parasieten (1 isolaat / pt) in 2004

47. In het MCH in Leuven werd de analyse ‘parasieten faeces’ 4809 keer uitgevoerd in 2004, met een positief resultaat in 10.8% van de stalen. • Frequentst gedetecteerd: Blastocystis hominis (273), Giardia lamblia (119) en Cryptosporidium (40). • Blastocystis hominis goed voor 46 % van tot aantal parasieten Gedetecteerde parasieten (1 isolaat / pt) in 2004 - MCH

48. Blastocystis hominis • Pathogeniciteit: controverse • Onduidelijkheid over classificatie, levenscyclus, transmissie • Komt wereldwijd voor • Diagnose: cyste - achtige structuur in faeces; nogal labiel • grootte sterk var (6 - 40 um) • vers preparaat • fixatie en permanente kleuring • Heel frequent (81/ 247 in Nederland, T Mank, 1997)

49. Blastocystis hominis Gramkleuring Lugol Trichroom • Ronde tot ovale cyste-achtige structuur met centrale vacuole, ring van cytoplasma met nuclei • Grootte sterk variabel

50. ‘Faeces parasieten’ in de praktijk: 2004