Medische Microbiologie

1. Medische Microbiologie Studietaak 1: De prokaryote cel: H4 (Bacteria; archaebacteria niet)

2. Wat is medische microbiologie? KLASSIEK: • Patiënt  arts  lichamelijk onderzoek  klinische diagnose • Monster-afname • Juiste monster (bloed, urine, pus, faeces, liquor) • Juiste afname, labeling, transport/opslag • Microscopisch onderzoek • gekleurd/ongekleurd (bijv. Gram-preparaat) • Kweek en reinkweek • op voedingsbodems • in voedingsmedia • identificatie m.b.v. biochemische en/of serologische testen • Gevoeligheid voor antibiotica • Diffusiemethoden, breekpunten/MIC MOLECULAIR: • Serologische diagnostiek: meting specifieke antistoffen • DNA-technologie

3. Eukaryoten • Groter, 2-20 µm • Gepaarde chromosomen • Kernmembraan • Histonen • Organellen • Ribosomen 80S (muv mito: 70S) • Evt. polysacharide celwand • Mitose Prokaryoten • Klein, < 2 µm • 1 circulair chromosoom • Geen kernmembraan • Geen histonen • Geen organellen • Ribosomen 70S • Peptidoglycaan- celwand • Binaire deling

4. Gemiddelde grootte: 0,2 –1,0 µm  2 - 8 µm • Basisvormen: zie boek!

5. Geen leerstof • Bijzondere vormen • Stervormige Stella • Rechthoekige Haloarcula • Meeste bacteriesoorten zijn monomorf (één vorm) • Sommigen zijn pleomorf (meerdere vormen) Figure 4.5

6. Rangschikkingen • Paren: diplococci, diplobacilli • Clusters: staphylococci • Ketens: streptococci, streptobacilli

7. Bouw van bacteriën • Celmembraan • Celwand • Flagellen/fimbriae/pili • Kernmateriaal • Endporen • Een of twee membranen • Slijmlaag/kapsel Figure 4.6a, b

8. Celwand • Voorkomt osmotische lysis • Is bij bacteriën gemaakt van peptidoglycaan Figure 4.6a, b

9. Peptidoglycaan • Polymeer van een disacharide dat is opgebouwd uitN-acetylglucosamine (NAG) en N-acetylmuraminezuur (NAM) • Verbonden door polypeptiden Figure 4.13a

10. G+ celwand G- celwand • Dunne peptidoglycaanlaag • Geen teichoïnezuren • Buitenmembraan • LPS (endotoxine) • Dikke peptidoglycaanlaag • Teichoïnezuren • Mycolinezuur*) • Geen LPS *): Bij zuurvaste cellen

11. Gram-positieve celwanden • Teichoïnezuren: • Lipoteichoïnezuur verbindt met plasmamembraan • Wand-teichoïnezuur verbindt met peptidoglycaan • Teichoïnezuren reguleren mogelijk de beweging van kationen • Polysachariden zorgen voor antigene variatie Figure 4.13b

12. Gram-negatieve buitenmembraan • Lipopolysachariden (LPS), lipoproteïnen, fosfolipiden • Omsluit het periplasma • Beschermt tegen fagocyten, complement, antibiotica • LPS: • Polysacharide-deel: antigeen; bv. onderscheiding van E. coli O157:H7 • Lipo-deel: lipide A, is een endotoxine • Porines (eiwitten) vormen kanalen door de membraan

13. Differentiatiekleuringen • Onderscheid in bacteriën maken op basis van kleuring (microscoop) • Gram-kleuring en Ziehl-Neelsen-kleuring (zuurvaste kleuring) Deze komen uit HOOFDSTUK 3!! (laatste paar pagina’s)

14. Mechanisme Gramkleuring • Er vormen zich kristalviolet-jodium (KV-I) kristallen in het cytoplasma • Gram-positieve cel: • Alcohol dehydrateert het peptidoglycaan • KV-I kristallen blijven in de cel • Gram-negatieve cel: • Alcohol lost buitenmembraan op en maakt gaten in peptidoglycaan • KV-I wordt weggespoeld

15. Gram Stain

16. Zuurvaste kleuring (Ziehl-Neelsen) • Cellen met mycolinezuur in hun celwand houden kleuring vast bij behandeling met zure alcohol: zuurvaste cellen • Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Nocardia, sommige Corynebacteriën • Niet-zuurvaste cellen verliezen de kleuring als ze gespoeld worden met zure alcohol en worden meestal tegengekleurd • Geassocieerde flora, ont- stekingscellen Figure 3.11

17. Speciale kleuringen • Negatieve kleuring bruikbaar voor kapsels • Verhitting nodig om endosporen te kunnen kleuren • Voor het kleuren van flagellen is een fixatief (mordant) nodig dat ze dik genoeg maakt om ze te kunnen zien Figure 3.12a-c

18. Medische Microbiologie Studietaak 1: De groei en het kweken van micro-organismen H6

19. Microbiële groei • Groei: toename aantal cellen (niet celgrootte!) • Benodigdheden/belangrijk: • Minimum, optimum, maximum kweektemperatuur • pH tussen 6,5 en 7,5 (m.u.v. alkalofiel, acidofiel) • Water (in lab: demiwater / milliQ) • Osmotische druk (m.n. bij halofiel, facultatief halofiel) • Koolstof, stikstof, zwavel, fosfor, spoorelementen, groeifactoren

20. THE REQUIREMENTS FOR GROWTH PHYSICAL REQUIREMENTS

21. TEMPERATURE

22. Psychrotrofen: • Groeien tussen 0°C en 20-30°C • Veroorzaken voedselbederf • Mesofielen: • Optimum groeitemperatuur 25-40°C • Meest voorkomende type, waaronder de meeste pathogene - en voedselbedervende m.o. • Micro-organismen die zich hebben aangepast aan het leven in een dierlijke gastheer: optimum temperatuur dichtbij die van gastheer • Veel pathogene bacteriën: optimum temperatuur 37°C

23. Geen leerstof • Hyperthermofielen: • Optimum temperatuur boven de 80°C • Archaea • Hete bronnen rond vulkanische activiteit • Meestal zwavel nodig voor metabolisme • Interessant voor de biotechnologie, als bron van hittebestendige enzymen Pyrococcus furiosus

24. pH

25. De meeste bacteriën groeien bij neutrale pH (6,5-7,5) • Fungi groeien bij zure pH (5-6) • Acidofiele bacteriën groeien in zure milieus • Kweken van bacteriën in het lab: uitscheiding van zuren (anaeroob katabolisme!) die de groei uiteindelijk gaan remmen  medium bufferen; mogelijke buffers: • In veel media zit pepton of aminozuren (als N-bron en als az-bron); deze bufferen • In veel media zitten fosfaat-zouten (als P-bron); deze bufferen, met name in het neutrale pH-gebied

26. OSMOTIC PRESSURE

27. Hypertone omgeving: plasmolyse • Conservering voeding via extra suiker of zout • Max. % agar in vaste media (anders te grote osmotische druk) • Hypotone omgeving (bv. demiwater): water de cel in, maar celwand behoedt cel meestal tegen lysis Figure 6.4

28. Geen leerstof Extremofielen • Bij de extremofielen die we tot nu toe gezien hebben (temperatuur, zout, zuur) gaat het vaak om Archaebacteriën (Archaea)

29. THE REQUIREMENTS FOR GROWTH CHEMICAL REQUIREMENTS

30. CARBON (Koolstof) • Als basis voor alle biomoleculen en als energiebron (covalente bindingen tussen C-atomen) • Chemoheterotrofen gebruiken organische stoffen (biomoleculen) als C- en energiebron • Autotrofen gebruiken CO2 als C-bron

31. NITROGEN, SULFUR, PHOSPHORUS, TRACE ELEMENTS • Stikstof: Nodig voor alle aminozuren, eiwitten • N-bron: • Meeste bacteriën breken eiwitten af • Sommige bacteriën gebruiken NH4+ of NO3 • Enkele bacteriën gebruiken N2 (stikstoffixatie) • Zwavel: nodig voor bepaalde aminozuren, thiamine, biotine • S-bron: • Meeste bacteriën breken eiwitten af • Sommige bacteriën gebruiken SO42 of H2S • Fosfor: Nodig voor DNA, RNA, ATP en membranen • P-bron: fosfaat • Spore-elementen: kleine hoeveelheden anorganische elementen, meestal enzym-cofactoren

32. OXYGEN

33. Zuurstof is essentieel voor het leven op aarde, maar het is in feite een giftig gas • Op de oer-aarde was er zeer weinig zuurstof en waarschijnlijk was er zelfs geen leven ontstaan als er (veel) zuurstof aanwezig was geweest • Levensvormen met aerobe respiratie hebben zuurstof nodig voor hun katabolisme, waarbij zuurstof wordt omgezet in ……: • Reultaat: veel ATP en neutralisatie van een potentieel giftig gas (win-win situatie! )

34. Naamgeving zuurstofbehoefte • Obligaat aeroben: • Hebben zuurstof nodig om te leven (aerobe respiratie) • Zonder zuurstof gaan ze dood • Facultatief anaeroben: • Gebruiken zuurstof, maar kunnen ook zonder (switchen tussen aerobe respiratie (veel ATP) en fermentatie (weinig ATP)) • Obligaat anaeroben: • Gebruiken geen zuurstof en kunnen er meestal ook niet tegen • Meesten: alleen fermentatie (incl. glycolyse) ; bep. soorten in staat tot anaerobe respiratie = respiratie met alternatieve elektronenacceptor

35. Obligaat (strikt) aeroob: • Vrijwel alle dieren (op organisme-niveau!), de meeste schimmels, verschillende bacteriën (bv. Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis) • Strikt aerobe micro-organismen kennen geen fermentatie • Dieren zijn strikt aeroob omdat ze het op organisme-niveau niet lang uithouden zonder zuurstof (te weinig ATP) • Veel ‘oxidatieve stress’ = giftige effect zuurstof, dus goed verdedigingsmechamisme tegen zuurstof nodig (zie later)

36. Facultatief anaeroben: • Hebben verdedigingsmechanisme tegen toxisch effect zuurstof • Groeien uiteraard beter met zuurstof dan zonder • Veel bacteriën (bv. Escherichia coli, Bacillus anthracis, Salmonella, bep. Lactobacilli)en veel gisten en bv. ook dierlijke cellen • Obligaat (strikt) anaeroben: • Zijn geen zuurstof gewend • Hebben daarom geen verdedigingsmechanisme tegen het toxische effect van zuurstof • Voorbeelden obligaat anaeroben met fermentatie: bep. Lactobacilli en andere darmflora-bacteriën, Clostridium botulinum, Clostridium tetani • Voorbeelden obligaat anaeroben met alternatieve elektronenacceptor (= anaerobe respiratie): methaanproduceerders (‘methanogenen’) in moerassen, spijsverteringsstelsel van herkauwers, anaerobe rioolwaterzuivering

37. Giftige vormen van zuurstof • Superoxide vrije radicalen: O2 • In kleine hoeveelheden gevormd tijdens aerobe respiratie, maar ook bij obligaat anaeroben • Zeer toxisch • Alle organismen die groeien in aanwezigheid O2 maken deze vorm van zuurstof onschadelijk via: Deze formule klopt niet, maar hij zit op deze manier in de ppt (gemaakt door de auteur) en ik kan deze niet aanpassen: zie boek voor correcte formule

38. Peroxide anion: O22 • Bevindt zich in de H2O2 uit de SOD-reactie • Giftig, dus: verder verwerkt via een van deze reacties (meestal katalase) : De onderste formule klopt niet, maar hij zit op deze manier in de ppt (gemaakt door de auteur) en ik kan deze niet aanpassen: zie boek voor correcte formule

39. Obligaat aeroben en facultatief anaeroben: • SOD en katalase/peroxidase ontgiften • Obligaat anaeroben: • Geen ontgiftende enzymen • Aerotolerante anaeroben: • Wel SOD, geen katalase/peroxidase • Gedeeltelijke ontgifting • Microaerofielen: • Waarschijnlijk geen ontgiftende enzymen, maar wel zuurstof nodig • Zuurstof niet giftig bij lage concentraties

40. Kies uit: Aerotolerante anaeroben, facultatief anaeroben, microaerofielen, obligaat aeroben, obligaat anaeroben

41. ORGANIC GROWTH FACTORS • Essentiële verbindingen • Biomoleculen die het organisme zelf niet kan maken • Om welke biomoleculen het precies gaat, is afhankelijk van de betreffende bacteriesoort: veel bacteriën kunnen alle of de meeste biomoleculen zelf maken • Vitamines, aminozuren, purines, pyrimidines

42. THE REQUIREMENTS FOR GROWTH CULTURE MEDIA

43. Definities • Definities: • (Kweek)medium: Mengsel van voedingsstoffen voor groei van micro-organisme(n) • Steriel: Geen levende m.o. aanwezig • Inoculum: Aan (kweek)medium toegevoegde m.o. • Enten: het toevoegen van het inoculum • Kweek of culture: M.o. in of op een (kweek)medium • Meestal van te voren samengesteld door commerciële leveranciers: ‘just add water’ en steriliseren

44. Agar • Complex polysacharide uit zeewier • Gebruikt voor de bereiding van vaste media: voedingsbodems, schuine agars e.d. • De meeste m.o. kunnen agar niet verteren • Wordt vloeibaar bij 100°C • Wordt weer hard bij ~40°C

45. Soorten media • Chemisch gedefinieerde media: • Exacte chemische samenstelling is bekend • Lastig te maken en langzame groei: alleen speciale toep. • Complexe media

46. Complexe media • Extracten, bv. van gist of vlees (vandaar dat nog vaak de term ‘bouillon’ wordt gebruikt; dateert uit de tijd van Pasteur) en • Peptonen • Korte, wateroplosbare peptiden, onstaan uit zure hydrolyse of enzymatische digestie van een eiwitbron (bv. soja, melk, ….) • Meest gebruikt voor het kweken in het lab • Voornaamste ingrediënt zijn eiwitten: energiebron, C-bron, N-bron, S-bron • Vitaminen en andere organische groeifactoren meestal via vlees- of gist-extract (= daarnaast ook extra C- en N-bron) • Bij anaeroob kweken MOET ook een suiker (meestal glucose) worden toegevoegd voor de energie!

47. Gedefinieerd vs. complex medium Table 6.2 & 6.4

48. Anaeroob kweken • Vloeibaar: • Reducerende media • Bevatten stoffen (thioglycolaat of oxyrase) die een verbinding aangaan met O2 • Vlak van te voren verhitten om gebonden O2 te verdrijven • Voedingsbodems: • Anaerobe vaten: zie volgende dia • Oxyrase/OxyPlate • Enzym oxyrase zet O2 om in H2O • Enzym in voedingsbodem: hele plaat wordt een anaerobe ‘kamer’: de OxyPlate • Geen speciale apparatuur nodig

49. Anaeroob vat • Zakje met natriumbicarbonaat en natriumborohydride bevochtigen • Er onstaat H2 en CO2 • Palladium combineert H2 met O2 ( H2O) Figure 6.5

50. Speciale kweekmethoden • Bij m.o.’s die niet op of in media groeien: speciale kweektechnieken nodig, zoals • Proefdieren • Celkweek • Veel m.o.’s groeien slechts bij 5-15% CO2 Figure 6.6