Blgo. Enrique Mamani Zapana Laboratorio de Metaxénicas Virales INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

1. VIGILANCIA DEL VIRUS DENGUE EN EL PERÚ Blgo. Enrique Mamani Zapana Laboratorio de Metaxénicas Virales INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

2. EL VIRUS • Familia: Flaviviridae. • Causa el Dengue y Dengue Hemorrágico. • Transmitido por mosquitos. • Es un virus ARN (Ácido Ribonucleico de una sola hebra). • Tiene 4 serotipos: (DENV-1, 2, 3 y 4).

3. VIRUS DENGUE PrM :Glicoproteína Precursor de M Protege a la proteína E M: Induce Acs. Nt y protección C y RNA: 11Kd Nucleocapside Epitopes céls T E: Principal Proteína Estructural (53-54kd) Glicoproteína

4. Aedes aegypti

9. Aislamiento Viral IgM IgG>1280 Seroconversion Diagnóstico Dengue Detección Antígeno DetecciónGenoma Situación Epidemiológica CLINICA

10. DINAMICA DE RESPUESTA INMUNE

11. ASPECTOS IMPORTANTES EN EL DIGNOSTICO • Ficha Clínica • Tipo de muestra • Obtención de muestras • Transporte y conservación de M. • Tipo de prueba

12. CRITERIOS PARA LA OBTENCION, CONSERVACION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS DE ACUERDO AL TIPO DE PRUEBA

13. PRUEBA DIAGNOSTICA SENSIBILIDAD % ESPECIFICIDAD% TARIKI IGM 99.3 98 DENGUE – INS PRUEBA DE REFERENCIA + - Total 149 2 154 + TARIKI IGM DENGUE 1 100 101 - INS Total 150 102 255 KIT ELISA DE CAPTURA IgM DENGUE IMPLEMENTACION: 2008 -2010 TRANSFERENCIA: 2010 lotes pilotos

14. ELISA CAPTURA IgM o IgG DENGUE ELISA CAPTURA IgM: Infección reciente. ELISA CAPTURA IgG: Infección secundaria ELISA INDIRECTA IgG: Infección pasada

15. IgM 6-10 días.......... 96% Sensibilidad 98% Especificidad Días Fiebre % IgM 1-5 56 6-10 96 20-30 93 40-60 23 Costa Rica, Panamá Nicaragua Guzmán et al., 97

16. PRUEBAS RAPIDAS IgM, IgG Y ANTIGENO.

17. PRUEBAS RAPIDAS ANTIGENO NS1, IgM, IgG Evaluación de pruebas rápidas de detección NS1Ag, IgM e IgG

18. PRUEBA ELISA ANTIGENO NS1 • Detecta antígeno NS1 • Suero de 1-5 días • Diagnostico temprano • de dengue. Sensibilidad 93% Especificidad 100% Sensibilidad(97.3%) en inf. aguda primaria Sensibilidad (70.0%) en inf. aguda segundaria VPP 100% VPN 97.3%. Evaluation of a commercial dengue NS1 antigen-capture ELISA for laboratory diagnosis of acute dengue virus infection V. Kumarasamya, A.H. Abdul Wahaba, S.K. Chuab, Z. Hassana, Y.K. Chema, M. Mohamada and K.B. Chua Journal of Virological MethodsVolume 140, Issues 1-2, March 2007, Pages 75-79

19. Aislamiento del virus Dengue • Inmunofluorescencia Indirecta • Acs. Monoclonales específicos tipo

20. AISLAMIENTO VIRAL Células cultivo C6-36 LINEA C6-36 NORMAL LINEA C6-36 CON EFECTO CITOPATICO

21. Diagnóstico Inmunohistoquímico en muestras fallecidos FHD/SCD Necrosis Focal Células Kupffer

22. RT- PCR • Diagnóstico • Vigilancia • Epidemiología Molecular • Estudios etiopatogenia • Vacunas

23. RT-PCR EN DENGUE RT PCR Dengue Multiplex Sensibilidad: 98% Especificidad: 98%

24. PCR EN TIEMPO REAL Detecta Cuantifica carga viral

26. ANALISIS GENETICO DEL DENV-1.- Las secuencias que obtuvimos se agrupan con el genotipo América-África, siendo el primer serotipo que reingreso al Perú en 1,990 Se mantiene la circulación del mismo genotipo desde su ingreso en el año 1,990. Aunque se han establecidos clados distintos que tienen correlación con el tiempo y espacio, se puede observar para el 2,007 la circulación de dos clados dispersos que abarca la zona norte de Perú y la zona central del país, respectivamente.

27. Árbol filogenético de secuencias para DENV-1 obtenidos mediante NJ con 500 repeticiones de la región E/NS1 considerando las secuencias reportadas en el GEN BANK y las obtenidas en el presente estudio.

28. ANALISIS GENETICO DEL DENV-2.- Las secuencias que obtuvimos hasta el presente corresponden a los genotipos América que ingresó a Perú en 1,995 y al genotipo América-Asia que ingreso en el 2,001. Se evidencia la relación del genotipo América Asia con la presencia de dengue hemorrágico.

29. Arbol filogenético de secuencias DEN2 de la región E/NS1 obtenidas mediante NJ, modelo Tamura Nei con 500 repeticiones, considerando secuencias previamente reportadas en el GEN BANK y las obtenidas en el presente estudio.

30. ANALISIS GENETICO DENV-3.- Se generó un árbol filogenético considerando las secuencias obtenidas en el presente estudio y algunas secuencias reportadas por otros países. Las secuencias que obtuvimos corresponden al DENV-3 genotipo INDIA. Se observa que desde su ingreso a Perú, este genotipo presenta alta dispersión, formando clados que se agrupan según los años y área geográfica, respectivamente. La presencia de este genotipo ha sido permanente a la fecha y esta relacionado con casos de dengue grave.

31. Árbol filogenético de secuencias DENV-3 de la región E/NS1 obtenidas mediante NJ, modelo Tamura - Nei con 500 repeticiones, considerando secuencias previamente reportadas en el GEN BANK y las obtenidas en el presente estudio.

32. ANALISIS GENETICO DENV-4.- Para el análisis también se consideraron secuencias reportadas al GENBANK por diferentes países a fin de establecer la distribución filogenética descritos por Rico-Hesse et. al. También se generó un árbol filogenético considerando las secuencias obtenidas en el presente estudio y algunas secuencias reportadas por otros países. Las secuencias que obtuvimos corresponden al DENV-4 genotipo INDONESIA.

33. Árbol filogenético de secuencias DENV4 de la región E/NS1 obtenidas mediante NJ, modelo Tamura - Nei con 500 repeticiones, considerando secuencias previamente reportadas en el GEN BANK y las obtenidas en el presente estudio.

35. CIRCULACION DE UN NUEVO LINAJE DEL VIRUS DENGUE 2 GENOTIPO AMERICA / ASIA EN LA REGION AMAZONICA DE PERÚ, 2010 Mamani E.1, Alvarez C. 2, García M. 1, Figueroa D.1, Gatty M.2, Guio H.3, Merino S.1, Valencia P. Calampa C. 2 , Franco L 4, Cabezas C.1 1 Laboratorio de Arbovirus – Instituto Nacional de Salud, Perú 2 Dirección Regional de Salud Loreto. 3 Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología – Instituto Nacional de Salud 4 Instituto Carlos III – España. Email: emamani@ins.gob.pe

37. Árbol filogenético de secuencias genéticas de la región E/NS1 del DENV-2 La secuencias corresponden a los años: 1995- 2001, 2001, y 2010. Mamani E et al. Circulación de un nuevo linaje del virus dengue 2 genotipo América/Asia en la Región Amazónica del Perú, 2010

38. Distribución del Serotipos de dengue Tipo 2 Perú 2011* SE 11 Fuente: INS hasta el 17/03/01

39. INTERPRETACION DE RESULTADOS DE • LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO • DE DENGUE • a. CASO CONFIRMADO • Resultado Positivo por RT-PCR. • Resultado Positivo de aislamiento viral. • Resultado Positivo a antígeno NS1. • Resultado Positivo de IgM en una sola muestra • Evidencia de seroconversión en IgG en muestras pareadas.

40. DIRECTIVA SANITARIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE DENGUE • La implementación de la nueva directiva de diagnóstico de laboratorio. -Vigilancia rutinaria -Vigilancia centinela en establecimientos -Detección temprana de brotes (30 a 50 muestras)

41. Acceso a NETL@b Ingresar el nombre de usuario y contraseña. y hacer click en “login”

43. Laboratorio de Microbiología y Biomedicina Chorrillos, Lima

44. Centro de Investigación de Enfermedades Tropicales ¨MaximeKuczynski¨, Iquitos-Loreto

45. CONTRIBUCION DEL LABORATORIO EN EL DIAGNOSTICO DE DENGUE • Manejo clínico del paciente (Hto. Plaq. y otros). • Confirmación de casos de dengue (serológicas virológicas y moleculares) • Demostrar y predecir severidad (carga viral en estudio) • Detección temprana circulación virus dengue en áreas nuevas (vigilancia basada en Lab.) • Detección temprana de nuevos serotipos y subtipos (vigilancia basada en Lab.)

46. CONTRIBUCION DEL LABORATORIO EN EL DIAGNOSTICO DE DENGUE • Estimado de incidencia después de epidemias • Confirmación casos y su caracterización (severos) • Caracterización cepas dengue (secuenciamiento) • Diseño de nuevas estrategias o herramientas de diagnóstico. • Diferenciar enfermedades similares (diagnóstico diferencial)

47. GRACIAS