Universidad Nacional de La Matanza Ciencias de la Salud - MEDICINA AU1 - Formación del Ser Humano

1. Universidad Nacional de La Matanza Ciencias de la Salud - MEDICINA AU1 - Formación del Ser Humano Aplicaciones del diagnóstico molecular en Genética Dra. Mariana Herrera

2. DESORDENES MONOGÉNICOS Aparecen cuando un gen está alterado en todas las células del organismo Las alteraciones se deben a mutaciones genéticas que son cambios en las secuencias de los nucleótidos de la cadena de ADN HERENCIA AUTOSÓMICA DOMINANTE HERENCIA AUTOSÓMICA RECESIVA HERENCIA LIGADA AL X HERENCIA MITOCONDRIAL

3. Patrones de herencia de una enfermedad monogenica

4. ENFERMEDADES DE ORIGEN POLIGÉNICO Originadas por la sumatoria de efectos aditivos de varios genes y de factores ambientales que las favorecen La recurrencia en un grupo familiar se establece en función de tablas estadísticas específicas de cada desorden. Enfermedades de origen poligénico analizables por Biología Molecular Diabetes juvenil Alzheimer Enfermedad celíaca Enfermedad cardiovascular Parkinson

5. AMPLIFICACION DEL ADN PCR: reacción en cadena de la polimerasa Ciclos: -Desnaturalización -Hibridación -Elongación ADN total Taq polimerasa Mg Buffer Primers

6. Pocas copias de un fragmento Millones de copias PCR 10 rep 20 rep 20 rep 10 rep

7. 5’ 3’ 5’ 3’ DNA diana 3’ 5’ Separación de las cadenas Desnaturalización Forward primer 5’ 3’ Pegador de los primers (annealing) 5’ 3’ Reverse primer Hacer copias (extensión)

8. Thermal cycle Thermal cycle Thermal cycle Las copias de PCR se incrementan exponencialmente con el número de ciclos En 32 ciclos se hacenmás de 1000 millones de copias (2 n = 2 32 copias)

9. Ejemplos de diagnósticos que se hacen por PCR (monogénicas) -Distonía de torsión temprana (autosómica dominante) • Ataxia de Friedreich (autosómica recesiva) • Enfermedad de Duchenne (ligada al X)

10. Se amplifica un fragmento de 250 pares de bases que contiene al triplete GAG con una PCR radiactiva y se corre en un gel de poliacrilamida.

11. Distonía primaria (PTD) Ctrol N/M Padre Madre Hijo Hija 250 pb 247 pb Se han descripto numerosos casos de aparición de novo de esta deleción

12. Microsatélites Son repeticiones de di, tri o tetranucleótidos un número n de veces dinucleótidos: ---ATATATAT(AT)n--- ---CGCGCGCG(CG)n trinucleótidos: ---CAGCAGCAG(CAG)n--- ---CCTCCTCCT(CCT)n--- tetranucleótidos: --(CATG)n-- ó --(CCGG)n-- Características: -Hay alelos con distinto número de repeticiones -Se heredan mendelianamente -Muchas enfermedades neurológicas se originan por un incremento anormal del número de repeticiones

13. Southern Blot • Extracción de una gran cantidad de ADN genómico total • Digestión con enzimas de restricción • Corrida electroforética • Transferencia a una membrana de nylon • Identificación de una zona específica del ADN con sondas marcadas • Se usa en diagnósticos de enfermedades como la Distrofia Miotónica.

14. FUNDAMENTOS DE LA TECNICA DE Southern Blot Corte mediante enzimas de Restricción.

15. SOUTHERN BLOT

16. Distrofia Miotónica (DM)

17. Secuenciación del ADN • Manual o automática • PCR con nucleótidos especiales • Permite conocer la secuencia exacta de pares de bases en un fragmento de ADN

21. Tecnología de Microarrays • Está basada en la idea de Southern de que moléculas de ADN marcadas pueden ser usadas para analizar otras moléculas de ADN unidas a un soporte sólido • El “Southern blot” fue el primer array • Análisis de expresión hibridando moléculas de ARNm a librerías de ADNc sobre membranas de nylon • Dot-blot con sondas ASO

23. Paneles de riesgo para enfermedades complejas: -Enfermedad arterial coronaria -Infarto de miocardio -Fibrilación auricular -Cuadro trombótico -Enfermedad arterial periférica Estudio de portadores de mutaciones recesivas (Panel Ashkenazi): Tay Sachs, Canavan, Gaucher, Galactosemia, Disautonomía Familiar, Bloom, Nieman Pick, Fibrosis Quística, Mucolipidosis, etc.

24. Al leer el informe de un estudio genético: • ¿Qué mutación/es se estudió/aron? • Si no se encontró ninguna mutación, ¿se puede descartar la enfermedad? • ¿Qué técnicas se usaron? ¿Es la técnica adecuada para el/la paciente? • ¿Cuál es el grado de informatividad del estudio? • ¿Existe una buena correlación genotipo/fenotipo?

25. DIFERENCIAS ENTRE POLIMORFISMO Y MUTACIÓN 94% 99.9% 0.1% 6%

26. TIPOS DE POLIMORFISMO Polimorfismo de secuencia Polimorfismo de longitud -----AGACTAGACATT---- -----AGATTAGACCTT---- -----(GATA)(GATA)(GATA)---- -----(GATA)(GATA)---- -----(GATA)(GATA)(GATA )(GATA )---- A los polimorfismos debidos al cambio de una base por otra en la cadena del ADN se los denomina Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).

27. ¿Cómo se transmiten los caracteres hereditarios de generación en generación? Padres Hijos

28. La Herencia de los Genes. La Fecundación + n 2n n = + Organismo unicelular. Embrión ESPERMATOZOIDE ÓVULO 23 CROMOSOMAS 23 CROMOSOMAS 23 PARES DE CROMOSOMAS HIJO

29. La herencia de los genes Gen de “la bondad” GAMETAS FEMENINAS GAMETAS MASCULINAS

30. “mucha bondad” “mediana bondad” “poca bondad” “excesiva bondad” Gen de “la bondad” Cada variante se denomina alelo. Imaginando este ejemplo, el gen de “la bondad” presenta cuatro alelos: “mucha bondad” “mediana bondad”“poca bondad”“excesiva bondad”.

31. “La bondad” de un hijo es el resultado de la interacción de los genes de la bondad que recibió de sus progenitores.

32. Gen “La bondad”Gen “La Inteligencia”Gen “La Belleza” Variantes Alélicas Mucha Bondad Gran InteligenciaExtremada Belleza Mediana BondadInalcanzable InteligenciaAmigable Belleza Poca BondadIncomparable InteligenciaMínima Belleza Excesiva Bondad

33. En cada individuo este grupo de genes puede presentarse con diferentes combinaciones.

34. Cuando más loci o genes se investiguen mayor será la caracterización de la persona y menor será la posibilidad de encontrar dos personas que compartan exactamente las mismas características. Los estudios de identificación biológica permiten determinar la huella propia de un individuo y reconocer el 50 % heredado de la madre y el 50 % heredado del padre.

35. Un fragmento de ADN se repite n veces “en tandem”. El número de repeticiones en que se encuentra se corresponde con un alelo. Los STRs Locus preciso De acuerdo a las leyes de la herencia, cada individuo tiene dos alelos, uno heredado de su madre y el otro de su padre Se observan alelos de 2, 3, 4, 5 y 6 repeticiones entre los individuos.

36. Pequeñas cantidades de ADN Grandes cantidades de ADN Los dos alelos de un STR de un individuo PCR 10 rep 20 rep 20 rep 10 rep

37. Material biológico a partir del cual pueden realizarse los estudios de identidad. Infinitas divisiones celulares Óvulo materno + espermatozoide paterno El niño tiene en todas las células de su organismo la misma información genética que en la célula originaria Puede utilizarse cualquier tejido para analizar su ADN.

38. Estudio de Paternidad. P+H+M Toma de muestras: sangre, cepillado bucal o uñas LABORATORIO FORMULARIO Nombre completo Fecha de nacimiento Nro. de Documento Relación con el Probando Huella digital Foto Firma Preparación del ADN de las tres personas P H M

39. ESTUDIO DE PATERNIDAD EN SECUANCIADOR AUTOMÁTICO

40. ESTUDIO DE MATERNIDAD

41. Herencia del Cromosoma Y Estudio de la Línea Paterna Todas las células masculinas tienen un cromosoma sexual X y uno Y (XY) Todas las células femeninas tienen dos cromosomas sexuales X (XX) Las gametas masculinas (espermatozoides) llevan o un cromosoma X o un cromosoma Y Las gametas femeninas (óvulos) llevan siempre un único cromosoma X X + X MUJER X X Y + Y X VARON

42. Herencia del Cromosoma Y XX XY XY XX XY XX XY XY ABUELO, HIJOS VARONES, NIETOS VARONES, HERMANOS VARONES, PRIMOS VARONES POR VIA PATERNA, TIO PATERNO Y SOBRINO, COMPARTEN EL MISMO CROMOSOMAY

43. El ADN mitocondrial presenta pequeñas regiones diferentes entre las personas mitocondrias núcleos espermatozoide + óvulo fecundación Primer célula embrionaria que originará todo el embrión

44. Herencia Mitocondrial Estudio de la Línea Materna DNA MIT.1 DNA MIT.2 DNA MIT.3 DNA MIT.5 DNA MIT.1 DNA MIT.1 DNA MIT.4 DNA MIT.5 DNA MIT.1 DNA MIT.1

45. POLIMORFISMO DE UN GEN Está dado por las diferentes variables en que se presenta en la población.

46. TIPOS DE POLIMORFISMO Polimorfismo de secuencia Polimorfismo de longitud -----AGACTAGACATT---- -----AGATTAGACCTT---- -----(GATA)(GATA)(GATA)---- -----(GATA)(GATA)---- -----(GATA)(GATA)(GATA )(GATA )---- A los polimorfismos debidos al cambio de una base por otra en la cadena del ADN se los denomina Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).

47. En cada individuo este grupo de genes puede presentarse con diferentes combinaciones.

48. Los seres humanos compartimos el 99,9% de nuestro genoma. Las diferencias responden a variaciones en tan solo el 0.1 % de la secuencia del ADN. DIFERENTES ALELOS EN LA POBLACIÓN

49. PROYECTO GENOMA HUMANO A partir de la secuenciación completa del genoma humano se ha determinado que existen aproximadamente 30.000 genes. Se encontraron más de 6.000.000 sitios con SNPs Pero lo importante fue entender cómo las diferentes variantes alélicas de un gen polimórfico se relacionan con características particulares de las personas. AAACCGG Bondad alta AAAACGG Bondad media TTTGGCC TTTTGCC Proyecto Genoma Humano GWAS (Genomic wide association studies)

50. Farmacogenética