Uso de Células Tronco na Terapia Celular: Fundamentos e Perspectivas

1. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Uso de Células Tronco na Terapia Celular: Fundamentos e Perspectivas Marco Antonio Zago Pro-Reitor de Pesquisa da USP Ribeirão Preto – Outubro 2010

2. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo A Miraculous Medicine I have seen a medicine That’s able to breathe life into a stone,Quicken a rock, and make you dance canaryWith spritely fire and motion, whose simple touchIs powerful to araise King Pippen, nay,To give great Charlemain a pen in 's handAnd write to her a love-line. W. Shakespeare All's Well That Ends Well

3. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Células tronco para a cegueira Notícias na Imprensa Cientistas britânicos pretendem usar células tronco para tratar uma forma comum de cegueira Pacientes cegos por queimaduras químicas recuperaram a visão após implante de células tronco em centro italiano

4. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Degeneração Macular Relacionada à Idade Forma “úmida” Proliferação vascular 10% casos Mais grave Várias formas de tratamento Forma “seca” Atrofia 90% casos Não há tratamento

5. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Fibroblastos humanos OCT4,SOX2, NANOG, LIN28 iPS iPS EPR Epitélio Intestinal Neural Cartilagem Epitélio Pigmentado Retiniano

6. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Fibroblastos humanos OCT4,SOX2, NANOG, LIN28 iPS iPS EPR Epitélio Intestinal Neural Cartilagem Epitélio Pigmentado Retiniano Royal College of Surgeons dystrophic rats

7. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Córnea e células tronco Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea Conjuntiva Limbo Córnea

8. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Córnea e células tronco Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea Conjuntiva Limbo Córnea Neovascularização Inflamação Cicatrização Deficiência parcial Destruição (queimadura) Invasão da córnea pelo epitélio conjuntival

9. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration Pacientes com perda de visão por queimadura da córnea Células do limbo contralateral obtidas por biópsia, cultivadas e implantadas Antes Depois Sucesso 82 (77%) Sucesso parcial 14 (13%) Insucesso 11 (10%) p63-bright cells: holoclone forming cells in culture NEJ Medicine 363:147, 2010

10. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo PESQUISA Cientistas brasileiros testam o uso de células-tronco contra cegueira O Globo RIO – O uso de células-tronco pode ser uma esperança para o tratamento de problemas graves de visão, como a retinose pigmentar, que leva à cegueria. .... Se der certo para retinose pigmentar – estima-se que no Brasil 40 mil pessoas sofrem desse mal – o tratamento poderá ser testado em outras doenças, como a degeneração macular relacionada com a idade (DMRI) e a retinopatia diabética. .... Daí a idéia de retirar as células da própria medula óssea desses pacientes, que em seguida foram processadas e injetadas no vítreo do globo ocular. Células tronco hematopoéticas Células tronco mesenquimais

11. Mono- nuclears Metho-Cult GF-H4434 medium 14 days 37o C 5% CO2 Colonies Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Ficoll-Hypaque gradient Bone Marrow Peripheral Blood Umbilical Cord

12. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo BFU-E BFU-E CFU-GM

13. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo CFU-GM CFU-GEMM

14.  - MEM 20% Fetal Calf Serum Mono- nuclears 72 hours Remove non-adherent cells 14 days Ficoll-Hypaque gradient Trypsin Detach cells Bone Marrow Umbilical Vein Weekly

15. Diferenciação Osteoblástica Dexametasone Ácido ascórbico Insulina Dexametasone Indometacina Diferenciação Adipocítica

16. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Fontes de MSC em Humanos Medula óssea Tecido adiposo Veias e artérias Tecidos Adultos Medula óssea fetal Fígado fetal Sague periférico fetal Sangue de cordão umbilical Veia de cordão umbilical Gônadas Tecidos Fetais Placenta Células fetais Células maternas

17. MSC de veia umbilical MSC Sudan II Fosfatase Alcalina Von Kossa H.E. Colágeno II

18. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo mTOR Síntese Ciclina D1 mTOR (FRAP1) Proliferação celular mammalian Target of Rapamycin Proteínas angiogênicas Angiogênse Serina/treonina proteino-cinase TSC1 e TSC2 Ativa metabolismo Inibidores de mTOR Inibidores de mTOR rapanalogs Tratamento de câncer PTEN regulador (inibidor) de mTOR Deleção de PTEN Síndrome mielodisplásica Leucemias

19. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

20. Células-tronco: Propriedades e Fontes

23. Blastocisto

24. Todos os tecidos doadulto

25. blastocisto adipócitos epitélio CT embrionários * corpo embrióide corpo embrióide fibras musculares neurônios Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Células-tronco Embrionárias Lygia V. Pereira Instituto de Biologia USP

26. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Propriedade Fundamental das Células-Tronco Divisão Assimétrica

27. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

28. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Célula-tronco Instestinal

29. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição Embrião Massa Interna CT Embrionária Massa Interna CT Embrionária iPS +Gata4/5 +Cdx2 Endoderma Trofoectoderma Progenitores Hematopoéticos +Oct3/4 +Sox2 +Klf4 (+cMyc) Progenitores -Pax5 +Cebp Cels Maduras Fibroblastos Músculos Células B Macrófagos Célula Acinar Célula  +Myod +Pdx1, Ng3n, Mafa

30. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

31. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Teratomas derivados de iPS Takahashi & Yamanaka

32. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição Embrião Massa Interna CT Embrionária Massa Interna CT Embrionária iPS +Gata4/5 +Cdx2 Endoderma Trofoectoderma Progenitores Hematopoéticos +Oct3/4 +Sox2 +Klf4 (+cMyc) Progenitores -Pax5 +Cebp Cels Maduras Células B Macrófagos Fibroblastos Músculos Célula Acinar Célula  +Myod +Pdx1, Ng3n, Mafa

33. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Células Tronco • Células tronco pluripotentes • células tronco embrionárias (blastocisto 4-5 dias) • células embrionárias germinais (feto 5-9 semanas) • iPS (induced pluripotent stem cell) • Células tronco de adultos • medula óssea • vasos • músculos esqueléticos • fígado • cérebro • dentes • intestino • pele • coração

34. Uso Terapêutico

35. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Doenças potencialmente tratáveis com terapia celular com células-tronco Diabete melito Infarto do miocárdio Miocardiopatias Cirrose hepática Câncer Grandes defeitos ósseos Doença de Parkinson Doenças auto-imunes Distrofias musculares Cegueria Doenças hematológicas Doenças metabólicas Doenças ósteo-articulares Fibrose pulmonar Defeitos da face Vasculopatia periférica D. vascular cerebral

36. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Doenças atualmente tratáveis com terapia celular com células-tronco Diabete melito Infarto do miocárdio Miocardiopatias Cirrose hepática Câncer Grandes defeitos ósseos Doença de Parkinson Doenças auto-imunes Distrofias musculares Cegueira Doenças hematológicas Doenças metabólicas

37. Registros de Trials Clínicos

38. The registration of all interventional trials is a scientific, ethical and moral responsibility. • There is a need to ensure that decisions about health care are informed by all of the available evidence • It is difficult to make informed decisions if publication bias and selective reporting are present • The Declaration of Helsinki • Every clinical trial must be registered in a publicly accessible database before recruitment of the first subject.

39. International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE) Obligation to Register Clinical Trials The ICMJE believes that it is important to foster a comprehensive, publicly available database of clinical trials. Trials Results and the Media Researchers will not publicize their work while their manuscript is under consideration or awaiting publication. Very little medical research has such clear and urgently important clinical implications for the public’s health that the news must be released before full publication in a journal.

40. 2.641 Studies with the tag: stem cells 2.418: hematopoietic stem cells Clinical Trials.gov

41. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Estratégias de Terapia com Células Tronco Estratégia Fonte de Células Células totipotentes Cultura Diferenciação Injeção/transplante Células tronco embrionários Células iPS Células tronco adultas tecido-específica Isolamento Enriquecimento, cultura Injeção/transplante Medula óssea Pele Olho S. nervoso

42. Infarcted myocardium Transplanted cells Unknown molecular signal(s) LVEDP 40 Cell migration to damaged area 30 Proliferation and differentiation mm Hg 20 10 Cytoplasmic proteins Cardiac myosin -Sarcomeric actin Connexin 43 Nuclear proteins Csx/Nkx2.5 MEF2 GATA-4 Functional competence Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium Donald Orlic, Jan Kajstura, Stefano Chimenti, Igor Jaloniuk, Stacie M. Anderson, Baosheng Li, James Pickel, Ronald McKay, Bernardo Nadal-Ginardi, David M. Bodline, Annarosa Leri & Piero Anversa Nature 410:701, 2000 C Infarction + BM cells

43. Transdiferenciação: • Fusão • Contaminação

44. Transdiferenciação: • Fusão • Contaminação

45. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Pesquisa Básica Pesquisa Translacional Pesquisa Clínica Evidência Médica Sólida Mudança da Abordagem Médica Resultados Avaliação

46. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Evidência Médica Sólida Trials com resultados convincentes Abordagem que modifica significativamente o desfecho clínio em relação aos tratamentos existentes estabelecidos Resultados são obtidos consistentemente por diferentes observadores Vantagem adicional é suficientemente grande para sobrepujar os riscos adicionais

47. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Evidência Médica Sólida Exceto para os tratamentos com base em transplante de células tronco hematopoéticas, tratamento de lesões da córnea e o uso de MSC como imunomoduladora, Há evidência médica sólida, não controvertida, que qualquer outra forma de terapia celular com células-tronco adultas seja vantajosa em um ambiente clínico? Não, não há evidência

48. Terapia Celular: Estratégias Substituição do tecido doente ou destruído Células tronco tecido-específicas Transplante de medula óssea Transplante de células pancreáticas Mesenquimais: osso e cartilagem Pele cultivada Células tronco embrionárias ou células iPS Células de m. óssea: regeneração de outros órgãos Imunoterapia + Transplante autólogo Diabete melito tipo I Efeito imuno-modulador Cels. tronco mesenquimais

49. Terapia Celular de Doenças Cardíacas Células Hematopoéticas Precursores hematopoéticas não originam cardio-miócitos MSC não originam cardiomócitos Derivadas de tecido hematopoético (linhagem monocítica) fundem-se com hepatócitos, cardiomiócitos, células de Purkinje, CT intestinais Precursoras hematopoéticas podem se incorporar no endotélio MSC são imunossupressoras MSC poderiam reduzir reação inflamatória Precursoras da medula óssea poderiam secretar substâncias bioativas localmente

50. Registered Clinical Trials with “Stem Cells” Clinical Trials Condition Stem Cell All Evidence* Heart Disease Myocardial Ischemia Myocardial Infarction Coronary Disease Heart Failure Cardiomyopathies Hypertension 127 101 62 44 36 20 9 4.489 2.010 631 1.433 934 218 2.218 C C C C No No No Peripheral Vascular Disease Stroke Diabetic Angiopathies Intracranial Hemorrhages 17 13 3 1 272 887 226 119 No No No No *Evidence = published results of convincing double-blind trials C = contradictory or non-reproducible results