Etude des événements précoces qui suivent la fécondation et conditionnent le cycle de division mitotique

Etude des événements précoces qui suivent la fécondation et conditionnent le cycle de division mitotique

Introduction Fécondation Pronuclei male et femelle Cycles de division et développement embryonnaire Fusion des pronuclei Divisions cellulaires ? réplication mitose initiation nucleus

Introduction La réplication et sa régulation: Etapes fondamentales pour la stabilité du génome réplication Taille du génome 1 fois par cycle cellulaire ~3000X taille de l’œuf

Introduction Les modèles d’études « classiques » de la réplication Levure Cellules somatiques Xénope Extraits d’œufs in vitro La réplication nécessite une étape d’initiation durant laquelle un complexe de pré-réplication est activé

Introduction Intérêts du modèle œuf d’oursin G1 méiose II S G2 Mitose Fécondation 1ere division Phase G1 Phase S G2 Mitose Traduction d’ARNm d’origine maternel Modifications post-traductionnelles de protéines existantes Pas de transcription au cours du développement embryonnaire précoce

Retrouve-t-on chez les échinodermes tous les gènes impliqués dans le contrôle de l’initiation de la réplication chez les vertébrés? Ces questions ont été rendues accessibles grâce au séquençage du génome de l’oursin.

Introduction DDK CDK Geminin Cdt1 Cdc6 ORC Mcm 2-7 Complexe de pré-réplication (pré-RC)

Analyse du génome d’oursin Les homologues de tous les composants impliqués dans la formation et la régulation du Pré-RC sont présents et exprimés aux stades embryonnaires précoces du développement Fernandez-Guerra, A., Aze, A., Morales.J, Mulner-Lorillon,O., Cosson, B., Cormier, P., Bradham, C., Adams, N., Robertson, A.J.,Marzluff, W.F., Coffman, J.A., and Genevière, A.M (2006). The genomic repertoire for cell cycle control and DNA metabolism in S.purpuratus. Dev Biol. 300:238-51

Comment et à quel moment les protéines du pré-RC s’associent elles aux origines à la chromatine? Quels sont les mécanismes régulant l’assemblage du complexe?

Méthodes Geminin Geminin Cdt1 Cdt1 Cdc6 Cdc6 GFP GFP GFP microinjection Sélection de clones possédant les gènes codant pour les protéines d’intérêts Amplification par PCR Production de protéines recombinantes en bactéries: Anticorps

A quel moment les protéines du pré-RC s’associent elles aux origines?

Résultats 30µm 30µm Cdt1 Cdt1 Extraits totaux Cytokinesis replication anticorps 2cells NF 5’ 10’ 20’ 30’ 40’ 50’ 60’ 70’ 80’ 90’ 100’ 75 KDa tubuline control Marquage immunofluorescent FITC Cdt1 FITC + DAPI 10’ 20’ 30’ 40’ 50’ NF

Comment et à quel moment les protéines du pré-RC s’associent elles aux origines à la chromatine? Quels sont les mécanismes régulant l’assemblage du complexe?

Résultats (1) Cdt1 Geminin Geminin Geminin Géminine Cytokinesis replication Extraits totaux 2cells anticorps NF 5’ 10’ 20’ 30’ 40’ 50’ 60’ 70’ 80’ 90’ 100’ 35 KDa tubuline control Immunoprécipitation Geminine NF 5’ 10’ 20’ 30’ 40’ 50’ 60’ 70’ 80’ 90’ 100’ Traitement émetine NF 10’ 20’ 30’ 40’ 50’ 60’ 70’ 80’ - Emetine + Emetine Geminine est synthetisée durant le premier cycle cellulaire puis dégradée avant la cytokinèse. Les 2 protéines intéragissent ensemble.

Résultats (2) Geminine Cdt1 FITC + DAPI 10’ 20’ 30’ 40’ 50’ NF FITC FITC + DAPI Des extraits de chromatine démontrent une colocalisation de geminine et Cdt1 au niveau de la chromatine et dans le cytoplasme

Conclusions (2) Geminin Geminin CDK Cdt1 G1 S G2 M S 1ere division 2ème division F Les protéines sont déjà présentes sur la chromatine dans les œufs non fécondés. Mouvements des protéines entre le cytoplasme et le noyau Régulation des protéines durant le cycle cellulaire? • Modifications post traductionnelles? • Protéolyse?

Illustration: Ernst Haeckel Equipe: Mécanismes cellulaires Cdk dépendants Genevière Anne-Marie Fayet Claire Iribarren Claudio

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