Obtention de la séquence nucléotidique codante pour la GFP

1. Obtention de la séquence nucléotidique codante pour la GFP I- Reverse transcription de l’ARN en ADNc par RT-PCR II- Amplification de l’ADNc codant pour la protéine fluorescente par PCR III- Vérification de l’amplification de l’ADNc par électrophorèse IV- Purification de l’ADNc pour l’étape suivante

2. I- Reverse transcription de l’ARN en ADNc par RT-PCR On utilise la RT-PCR pour obtenir l’ADNc totale de l’organisme fluorescent. RT-PCR : reverse transcription de l’ARNm en ADNc, c’est-à-dire que la RT- PCR retranscrit l’uracile de l’ARN en thymine de façon à donner un brin d’ADNc. Comment passe-t-on de l’ARN à l’ADNc ? Schéma : s

3. II. Amplification de l’ADNc codant pour la protéine fluorescente par PCR • Schéma: un cycle de PCR: (spécifiques) X 26 cycles

4. III- Vérification de l’amplification de l’ADNc par électrophorèse L’électrophorèse permet la migration de l’ADNc du négatif vers le positif (car celui-ci est négatif). Plus la taille est petite, plus la molécule migre vers le pôle positif. Echelle C3 T1 C4 C1 C2 En paires de bases 2 000 1 500 1 000 500

5. On mesure la distance entre le puits et les résidus fluorescents : L’échelle est :

6. D’après cette échelle on peut tracer la courbe représentative suivante: #Grâce à cette courbe nous pouvons dire que pour: _ C3, le résidu fluorescent dans le gel correspond aux oligonucléotides. _ T1, le résidu fluorescent dans le gel correspond à 750 paires de bases d'ADNc. _ C4, le résidu fluorescent dans le gel correspond à 750 paires de bases d'ADNc.

7. IV- Purification de l’ADNc pour l’étape suivante Prélèvement au scalpel La purification sert à enlever l’excès de tampon, de dNTP, d’enzymes et d’amorces et donc à obtenir un ADNc pur. On obtient un ADNc pur qui servira pour l’étape suivante. 1000 pb 500 pb

8. Ce diaporama vous a été présenté par les experts du NCIS: • _ Florent • _ Virgile • _ Elodie • _ Alice • _ Coline