DNA diagnostika a principy základních metod molekulární biologie

1. DNA diagnostika a principy základních metod molekulární biologie

2. Mol. biologická diagnostika • diagnostika na úrovni DNA, RNA a proteinů • analýza kvalitativní i kvantitativní • proč se provádí • detekce přítomnosti nukleové kyseliny specifické sekvence • např. identifikace živočiš. druhu nebo jedince • analýza struktury (souvislé sekvence) nukleové kyseliny • stanovení genotypu • např. detekce klinicky významných mutací a polymorfizmů • kvantifikace nukleové kyseliny (RNA) se specifickou sekvencí • hodnocení intenzity a změny exprese genů (např. tumory) • kvantifikace proteinů a typů jejich post-translační modifikace • nejpoužívanější techniky • DNA • PCR, RFLP (analýza délky restrikčních fragmentů), elektroforéza, S-hybridizace, exprese, klonování • RNA • reverzní transkripce, kvantifikace, N-blotting, • proteiny • PAGE elektroforéza, W-blotting, protilátky, imuno- precipitace, ELISA, kapalinová chromatografie (HPLC), hmotnostní spektroskopie, ..

3. Izolace nukl. kyselin a proteinů • lýza buněk či tkání (lyzační pufry) • složení pufru odpovídá záměru (lysozym, proteinázy, detergenty, chelatační činidla) • odstranění ostatních kontaminujících částí s výjimkou požadovaného výsledného materiálu • izolace nukl. kyselin na základě • rozdílné rozpustnosti • adsorpce na pevný podklad • ultracentrifugace

4. Elektroforéza DNA nebo proteinů • základní separační technika při analýze nukleových kyselin nebo proteinů • principem separace je pohyb nabitých molekul (v případě DNA negativně nabitých fosfátů k anodě) v elektrickém poli • v pevném nosiči (gel) a vodivém pufru • gely • polyakrylamidové(PAGE)= vertikálně • agarózové = horizontálně • elektroforézy horizontální či vertikální, popř. kapalinové • rychlost pohybu v gelu je nepřímo úměrná (logaritmu) velikosti molekuly • velikostkonkrétní molekuly se určí pomocí velikostních standardů • po separaci (při určité hodnotě mV po určitou dobu) je nutno separované molekuly zviditelnit • DNA • dvojvláknová – ethidium bromid (interkalace) + UV • jednovláknová – SYBR green nebo barvení stříbrem • proteiny • přímo v gelu (Coomassie modř) • po W-blottingu protilátkami na membráně • modifikace • pulzní elektroforéza • denaturační gradientová (DDGE) • SSCP • heteroduplexy

5. Elektroforéza - postup

6. Elektroforéza DNA

7. Elektroforéza proteinů

8. Identifikace proteinů: W-blotting

9. Manipulace s nukl. kyselinami • amplifikace (n-kopií) • Polymerase Chain Reaction (PCR) • enzymy, které specificky zasahují do jejich struktury (spec. DNA nebo RNA) • polymerázy – syntetizují nukl. kyseliny • fosfatázy, kinázy, metylázy – modifikují • ligázy – spojují nukl. kyseliny • nukleázy – odbourávají, štěpí • restrikční endonukleázy = sekvenčně specifické enzymy bakterií (obrana před bakteriofágy) - >3500 enzymů • rozpoznávací místo (často palindrom) • názvy podle rodového a druhového jména organizmu (např. ) • klonování do vektorů • hybridizace • různá pevnost kovalentních a vodíkových vazeb v DNA • schopnost denaturace x renaturace • hybridizační sondy • hybridizace na membráně, in situ (FISH)

10. Klonování DNA • jedna z nejzákladnějších metod molekulární biologie • studium struktury a funkce genů (kódujících i regulačních oblastí) • produkce rekombinantních proteinů (genové inženýrství) • tvorba genových (cDNA) knihoven • tvorba transgenních organizmů • klonování = proces tvorby klonů • klon= soubor identických dceřinných buněk (organizmů) vzniklých mitózou z jedné mateřské buňky • molekulární (DNA) klonování = tvorba klonů DNA • tvorba rekombinantních molekul DNA množením v hostitelské buňce • rekombinantní DNA = vznikla spojením DNA fragmentu (inzertu) a vektoru in vitro • vektor = systém, který má schpnost přijmout cizorodou DNA a replikovat se v hostitelské buňce • plazmidové vektory • bakteriofágové vektory • umělé chromozomy (bakteriální, bakteriofágové nebo kvasinkové) • viry • proces klonování • příprava rekombinantní DNA (vpravením inzertu do vektoru) • inzert – DNA izolovaná z organizmu, cDNA, produkt PCR • přenos rekombinantní DNA do hostitelské buňky (= transformace bakterií, typicky E. coli) • chemicky nebo elektricky • selekce klonů obsahujících rekombinantní DNA • součástí vektoru je gen kódjící rezistenci k určitímu antibiotiku, bakterie bez vektoru nerostou na půdě s antibiotikem • pomnožení rekombinantích klonů a jejich další použití • transfekce eukaryontních buěk, exprese proteinu, …

11. Klonování DNA - využití • klonování = tvorba klonů (identických molekul DNA) • rekombinantní DNA vznikne spojením inzertu (cizorodé DNA) s vektorem • aplikace • studium funkce izolovaných genů • studium regulačních oblastí genů • fyzikální a genetická analýza genomů • exprese cizorodých genů a tvorba rekombinantních proteinů

12. Příklad – komerční klonovací vektor

13. Klonování - postup

14. ATB selekce transformovaných bakterií

15. Klonování DNA není klonování organizmu

16. Enzymy pro manipulaci s DNA • všechny enzymy mají substrátovou specifitu – tedy DNA nebo RNA • restrikční endonukleázy • sekvenčně specifické enzymy produkované kmeny většiny bakterií (slouží jim k degradaci cizorodé DNA , např. plazmidu nebo bakteriofága) • dnes známo cca 3 500 enzymů (procca 160 různých sekvencí) • název podle rodového a druhového jména bakterie • např. Eco (E. coli), Hae (Haemophilus aegypticus), Sau (Staphyloccocus aureus) • rozpoznávají různé krátké sekvence nukleotidů – 4 – 8bp (rozpoznávací místo je častopalindrom) a tak štěpí DNA na různě dlouhé fragmenty podle individuálního pořadí bází a podle rozpoznané sekvence • vznikají restrikční fragmenty (restrikční mapa) • DNA polymerázy • připojování nukleotidů v 5’  3’ směru

17. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) • charakterizace DNA pomocí jejího štěpení enzymy - restrikčními endonukleasami na fragmenty • identifikace a analýza produktů štěpení se provádí elektroforetickým dělením • za daných podmínek vzniká reprodukovatelný počet restrikčních fragmentů o určité opět reprodukovatelné délce (= počtu bazí) • počet i délka fragmentů je pro daného jedince specifická • využití • mutací v daném úseku DNA se může ztrácet nebo naopak vytvářet restrikční místo • RFLP často následuje po amplifikaci DNA pomocí PCR k definitivnímu určení genotypu • určení totožnosti (forenzní účely, paternita)

18. Hybridizace nukl. kyselin • používá se k vyhledávání známých sekvencí v genových knihovnách a na chromozomech • využívá se schopnosti DNA denaturovat (při vysokéteplotě) a zpětně renaturovat • kovalentní vazby kostry jsou mnohem pevnější než vodíkové vazby mezi páry bází • při přítomnosti značené sondy část komplementární sekvence DNA renaturuje s ní • provádí se • přímo na buňkách • po blottingu na membráně • na řezech tkání (in situ) • sondy • značeny radioaktivně (32P, 35S) • značení fluorescenční • např. FISH (fluorescent in situ hybridisation)

19. Southern hybridisation

20. FISH

21. cDNA knihovny • geny má určitý živočišný druh v kompletní výbavě v jádře každé jednotlivé buňky • ovšem exprese jednotlivých genů je specifická pro jednotlivé tkáně a různé situace • zdraví  nemoc • ovlivňení nějakou látkou  bez ovlivnění • pokud se izoluje RNA z nějaké tkáně či skupiny buněk, přepíše se reverzní transkripcí do cDNA a ta se naklonuje do bakterií, vzniká tzv. icDNA knihovna, ve které se dají vyhledávat specifické geny, porovnávat kvantita jejich exprese atd.

22. Microarrays

23. PCR • popsal v r. 1983 Kary Mullis, 1993 Nobelova cena • princip • enzymatická amplifikace DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích (denaturace ~95°C, annealing ~60°C, extenze ~72°C) • komponenty reakční směsi pro PCR • voda • pufr • dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGT) • MgCl2 • termostabilní DNA polymeráza (například Taq z bakterie Thermus aquaticus) • oligonukleotidové sondy (“primery”) • templátová DNA • teplotní režim • 1) 95ºC 2‘ iniciální denaturace • 2) 96ºC 30‘‘denaturace • 3) 40-72ºC 20‘‘ annealing • 4) 72ºC 30‘‘ elongace • kroky 2 – 4 celkem 30x • 5) 72ºC 5‘ závěrečná elongace • 6) 4ºC 10‘ zchlazení

24. PCR • produkt PCR reakce je možno zviditelnit UV světlem po elektroforetickém rozdělení (nejč. v horizontálním 1-3% agarózovém gelu) a obarvení interkalačními barvivy

25. Sekvenování DNA • metoda ke zjištění primární sekvence úseku DNA • nejčastěji se používá modifikací tzv. Sangerovy metody • je založena na PCR a používá kromě základních nukleotidů ještě značené ddNTP (= terminátor reakce katalyzované DNA polymerázou) • radioaltivně značené ddNTP – nutné 4 separátní reakce • fluorescenčně značené ddNTP – pouze 1 reakce

26. Sekvenování DNA

27. DNA diagnostika • proč se provádí • detekce přítomnosti nukleové kyseliny (detekce přítomnosti specifické sekvence) • např. identifikace živočiš. druhu • identifikace jedince (forenzní) • analýza struktury (souvislé sekvence) nukleové kyseliny • stanovení genotypu • např. detekce klinicky významných mutací a polymorfizmů • dědičné choroby • mutace v onkogenech a supresorových genech v nádorech • kvantifikace nukleové kyseliny se specifickou sekvencí • microarrays • cytogenetika • chromozomové aberace • karyotyp