Praktiká 12 LS

1. Praktiká 12 LS • Virologická diagnostika • Rýchle diagnostické metódy • Genetické sondy a PCR • Antibiotiká

2. Virologická diagnostika - priama • Vírusy nie je možné kultivovať na umelých médiách – izolujeme ich na živých modeloch - kuracie embryo, tkanivové kultúry – (tkanívá ľudské alebo zvieracie), bunkové línie – nádorové bunky, ktoré sa nekontrolovateľne delia aj na umelýchpovrchoch – laboratórne sklo • Mikroskopia – elektrónová, fluorescenčná • Dôkaz antigénu (ELISA, Latex) • Dôkaz genetickej informácie (PCR, genetické sondy) - nepriama • dôkaz protilátok v sére pacienta (sérol. reakcie)

3. Pomnoženie vírusu v kuracom embryu a jeho dôkaz • Do kuracieho vajíčka tenkou ihlou cez škrupinu inokulujeme testované tkanivo, v ktorom chceme dakázať vírus a necháme pomnožovať 14 dní. Ak bol v tkanive vírus prítomný, pomnoží sa v ňom a • Embryo odumrie • Vytvoria sa v ňom špecifické zmeny. Prítomný vírus pomnožený v kur.embryu dokazujeme ďalšími testami na dôkaz antigérnu (fluorescencia, ELISA, PCR. Elektrónová mikroskopia)

4. Pomnoženie a dôkaz vírusu na tkanivových kultúrach a bunkových líniách • Testované tkanivo naočkujeme do izolovaného tkaniva ľudských alebo zvieracích orgánov – opičie obličky, fetálna pečeň, HeLa bunky... • Vírus sa na nich pomnožuje • Identifikujeme – na základe viditeľných zmien buniek tkanivového modelu = cytopatický efekt (CPE) – elektrónovou mikroskopiou, dôkazom antigénu (Latex, ELISA), dôkazom genetickej infomácie (PCR), vírus neutralizačným testom – po pridaní špecifickej protilátky do modelu sa vírus nepomnoží), Interferenciou – niektoré vírusy sa nepomnožujú v prítomnosti iných

5. ELISA • Na povrch polystyrénovej jamky je naviazaný antigén. Sérum, v ktorom hľadáme protilátky pridáme do jamky. Ak v sére je protilátka, naviaže sa na antigén, ktorý pevne lpie na povrchu jamky. Nenaviazanú protilátku odplaví při premývaní voda. • Pridáme ďalšiu protilátku (komerčnú označenú farbičkou, alebo enzýmom, ) proti hľadanej protilátke v sére. Ak je naviazan na platničku cez antigén, naviaže sa aj komerčná protilátky. • Túto potom môžme detekovať podľa zmeny farby.

6. Princíp ELISA testu

7. Imunofluorescencia IFT • Na podložnom sklíčku máme antigén protilátky proti ktorému testujeme v sére. Pridáme sérum s hľadanou protilátkou, ktorá vytvorí pevný komplex. Pridáme ďalšiu protilátku - proti komplexu Ag a Ab vytvorenom na sklíčku - označenú fluoresceínom. Ak vznikol komplex antigén–protilátka-2.protilátka s fluoresceinom - vo fluorescenčnom mikroskope sledujeme fluorescenciu.

8. Princíp imunofluerescenčného vyšetrovania protilátok

9. Western blot • Na prúžku papiera je nanesená a elektroforézou rozložená antigénna štruktúra vírusu alebo baktérie. • Pridáme na prúžok sérum. Ak obsahovalo protilátky proti vírusu alebo baktérii naviažu sa zodpovedajúcom mieste prúžku. Po pridaní ďalšej protilátky proti komplexu ag-ab s farbičkou, sa zviditeľnia na prúžku. • Môžme oddiagnostikovať prítomnosť protilátok proti viacerým antigénom mikroorganizmu

10. Dôkaz antigénu ELISA a IF testom • Tieto testy môžu byť nastavené aj tak, že na pevnom povrchu (jamka mikrotitračnej doštičky, povrch skíčka), je naviazaná špecifická protilátka proti vírusu, ktorý chceme dokázať (vo vzorke z kur.embrya, z tkanivovej kurtúry). Po pridaní testovanej vzorky vzniká komplex Ab+Ag. Potom použijeme značenú protilátku proti komplexu a detekujeme ako v predošlom prípade.

11. Rýchle diagnostiké metódy • Ak nie je možné čakať na diagnostiku niekoľko dní (dôkaz baktérií) alebo týždňov (vírusy) je možné využiť na predbežný dôkaz rýchle testy: • - dôkaz antigénu vo vzorke (moč, CSM, krv, tkanivo) – latexovou aglutináciou, - mikroskopickým preparátom – natívnym, farbeným, fluorescenciou, • - PCR alebo genetickými sondami, ELISA

12. Latex aglutinácia • Na latexové čiastočky je naviazaná špecifická protilátka proti antigénom baktérie alebo vírusu. Po pridaní vzorky – moč, CSM, krv ....sa mikroorganizmus špecificky naviaže na tieto protilátky a tým aj na latexové čiastočky a dôjde k viditeľnej aglutinácii • Latexové čiastočky zvyšujú citlivosť. Stačí menšie množstvo mikroorganizmov, aby bolo možné voľným okom sledovať aglutináciu

13. PCR • Každý organizmus – aj mikroorganizmus – obsahuje jemu špecifickú sekvenciu aminokyselín • Pomocou enzýmov je možné túto sekvenciu „vystrihnúť“ a vo vzorke (tkanivo, embryo, moč, CSM....) nasyntetizovať na milionov kópii. • Tieto potom identifikujeme prostredníctvom „protilátky“ proti tejto sedkvencii – značenej enzýmom, fluorescenciou a pod.

14. Genetické sondy • Na podobnom princípe pracujú genetické sondy. • Priamo v odobratom tkanive (ster z krčku maternice.....) sa identifikuje prítomnosť vírusu (napr.) prostredníctvom identifikácie jeho špecifickej sekvencia amínokyselín. Túto uskutočníme pridaním značenej protilátky ku tkanivu.

15. Citlivosť na ATB - kvalitatívna • Platňový test – DDT – difúzny diskový test – na pôdu v petriho miske naočkujeme testovanú kultúru – na povrch priložíme disk z filtračného papiera napustý antibiotikom. ATB difunduje do okolia a ak je účinné voči skúmanému mikroorganizmu, dôjde k zábrane rastu – vytvorí sa zóna inhibície. Jej presný priemer je rôzny pre rôzne mikroorganizmy a rôzne ATB • Určíme len + alebo -, nemôžme odhadnúť stupeň citlivosti prípadne vývoj

16. Citlivosť na ATB kvantitatívna MIC • V rade skúmaviek (jamiek, filtračných papierikov) pripravíme geometrickým riedením klesajúcu koncentráciu ATB. • Do každej zo skúmaviek pridáme suspenziu testovanej baktérie a inkubujeme • Odčítame koncentráciu, v ktorej sa už baktéria nepomnožila = minimálna inhibičná koncentrácia – najnižšia koncentácia ATB, ktorá zabráni pomnoženiu baktérie. • (Ak poznáme koncentráciu ATB v tkanivách pacienta dosiahnuteľnú pri určitom dávkovaní, ich porovnaním môžeme odhadnúť účinnosť liečby) • V skúmavke nevidíme aká baktéria sa prípadne či tam rastie len jeden druh (nevidíme kontamináciu)

17. MBC • Vyočkovaním tekutiny z MIC jamiek alebo skúmaviek na kultivačné médium a inkubáciou určíme, či koncentrácia antibiotika baktériu len inhibovala (zastavila) jej rast alebo zabila.

18. E test • Využíva výhody difúzneho testu a MIC testu. Prúžok napustený ATB v stúpajúcej koncentrácii je položený na pôdu v petriho miske, na ktorej je naočkovaný testovaný kmeň.

19. Western blot – Proteiny antigénu testovaného vírusu sú elektroforeticky separované a nanesené na nitrocelulózový papierový prúžok. Ten sa potom inkubuje spolu s protilátkami – sérom –pacienta, premyje sa, aby došlo k odstráneniu nenaviazaných protilátok a potom reaguje s konjugátom protilátky proti komplexu ag-ab s naviazaným enzýmom. Sérum apcienta sa naviaže na antigény na nitrocelulóze len tam, kde identifikuje vlastný špecifický antigén k protilátke v sére. Tento test sa používa na vylúčenie nešpecifických reakcií ELISA testov napr. ako konfirmačný test pre HIV infekciu ap.

20. PCR – polymerázováý reťazová reakcia – je rýchlou metódou na pomnoženie – amplifikáciu známej DNA. Vzorka sa zmieša s termostabilnou DNA polymerázou, DN-trifosfátmi a 2 DNA molekulami špecifickými - primermi - ,ktoré sú komplementárne so zakončeniami cieľovej sekvencie, ktorú chceme amplifikovať. Zmes je zahriata a tým denaturovaná, schladená, čo umožní väzbu primeru na cieľovú DNA a jej namnoženie. Cykly sa opakujô 32 krát. Po prvom cykle sa amplifikujú len sekvencie, ktoré boli rozložené primerom – Týmto je možné v krátkom čase 6 hodín, veľmi špecificky dokázať suspektný vírus alebo baktériu vo vzorke – napr. TBC v spúte ap.)

21. ELISA test na detekciu protilátok alebo antigénu Dôkaz protilátok –1. vírusový antigén je naviazaný na povrch 2. Pacientovo sérum sa pridá a umožní sa mu väzba jeho protilátok na antigén na povrchu. Nenaviazané sérum je odstránené premývaním. 3. S enzýmom konjugované protilátky proti ľudským imunoglobulínom sa pridajú a po inkubácii opäť odstránia premývaním. 4Pridá sa substrát, ktorý umožní farebnú reakciu enzýmu Dôkaz antigénu – 1 antivírusové protilátky sú naviazané na povrch 2. pridá sa vzorka obsahujúca antigén – CSM, tkanivo, nenaviazaný antigén je po inkubácii odstránený premývaním. 3. Pridajú sa antivírusové protilátky na vychytenie antigénu. 4 Pridajú sa s enzýmom konjugované protiláky proti komplexu a 5 substrát, ktorý umožní farebnúú reakciu

22. Imunofluorescencia. Antigén je možné detekovať piamo naviazaním protilátok označených fluoresceinom alebo nepriamo za pouzžitia antivírusových protilátok a značenýžch protilátok proti imunoglobulínom Imunofluorescencia lokalizuje herpesvírusom infikované nervové bunky v reze mozgu pri herpetickej encefalitíde

23. In situ lokalizácia CMV infekcie za použitia genetickej sondy. CMV infekcia obličkových tubulov je lokalizovaná označenou CMV špecifickou DNA sondou a zviditeľnená podobne ako pri ELISA teste reakciou enzým substrát. Dôkaz vírusom infikovanej bunky DNA sondou – Vírusom infikované bunky môžu byť likalizované na histologických preparátoch z tkaniva prostredníctom DNA sondy. DNA sonda (obsahujúca asi 9 nukleotidov) Sonda sa pridá ku vzorke Vzorka je zahriata kvôli denaturácii DNA a schladená kvôli hybridizácii komplementárnej sekvencie. Celý systém je zviditeľnený reakciou enzým substrát

24. Tvorba špecifických mikroskopických obrazov v tkanive infikovanom vírusom: mnohojaderné obrovské bunky viditeľné v pľúcach pacienta s morbilovoou pneumóniou. Negriho telieska spôsobené infeciou vírusom besnoty v reze mozgu infikovaného pacienta

25. Cytopatický efekt HSV. A neinfikované Vero bunky B HSV-1 infikované Vero bunky – okrúhle mnohojadrové bunky a strata jednovrstvovej organizácie bunkovej kultúry B: Infikovaná bunka má malé kondenzné pyknotické jadro HSC indukuje CPE – A: V bioptickej vzorke je vidieť eozinofilné intranukleárne inklúzie s Halo a prstencom chromatínu v nukleárnej membráne

26. Systémy na pomnožovanie a izoláciu vírusov • Ľudia • Zvieratá: kravy, hydina, myši, krysy, sajúce myšky • Kuracie embryo • Orgánové a tkanivové kultúry: kultúry z orgánov, primárne tkanivové kultúry, bunkové línie – diploidné, nádorové a imortalizované bunkové línie – HeLa bunky (bunky obvykle z nádorov,ktoré stratili schopnosť apoptózy – naprogramovanej bunkovej smrti a neustále sa množnia)

27. Typy cytopatických efektov • Bunková smrť – zaguľatenie bunky, degenerácia, agregácia, strata schopnosti viazať sa na substrát • Charakteristické histologické zmeny: Inklúzne telieska v jadre alebo cytoplazme, marginácia chromatínu • Tvorba syncýcií: mnohojadrové obrovské bunky spôsobené vírusom navoden fúziou buniek • Zmeny povrchu buniek: Zmena expresie antigénu, hemadsorbcia (spôsobená expresiou hemaaglutinínov)