Le 24 Novembre 2011

1. Le 24 Novembre 2011 Cours de chromatographie d’exclusion Professeur SAALAOUI Ennouamane

2. CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION FILTRATION TAMISSAGE MOLECULAIRE Chromatographie par perméation de gel Chromatographie dexclusion -diffusion Chromatographie dexclusion –de taille généralement Chromatographie d’exclusion stérique Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

3. Perméation de gel Chimie macromoléculaire Phase mobile est de nature organique Filtration sur gel Biopolymères commeprotèines La phase mobile est aqueuse Chromato d’exclusion de taille Silices greffées et non des gels Chaînes poly-2hydroxyméthyl aspartamide Bcp de NH2 , OH , CO caractère hydrophile Liaisons hydrogènes crée des ponts des chaînes polyaspartamide Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

4. Le principe de la chromatographie d’exclusion • Le tamissage moléculaire (pores) • Séparation en fonction de la taille • -Le chemin parcouru par les molécules dépend de leur taille • Les plus grandes s’excluent • Les plus petites s’inclusent Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

5. Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

6. liaison a1-6 et 1-4 dextrane (polymères de glucose) des ponts 1959 Branchement + Réseau + ou - serré SéphadexG10, G15, G200 Degré de réticulation décroissant Mailes + en+ grandes Le choix en fct de la taille des molécules à séparer Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

7. VP VS Vo VP VS VS VP Principe de l’exclusion Vo= Vm Vi= Vp Vs = VG VT = Vo + Vp + Vs Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

8. Vo = volume mort = Vm Vp =volume des pores Vs =volume interne =Vg VP Vp Vo Vs VS Vo VP VS VS VR VT Vo VP Vc Différents volumes sur le chromatogramme Vc = Vo + VP + VS VT = Vo + VP Volume de la colonne Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

9. log PM 0 f 1 Ou Ve VR Vo VP VC = Vo + VP + VS VT = Vo + VP VS est négligeable VT = Vc f = fraction des pores VR = Vo + VP f . K . 1-0 f=0 Si K=1 molécules diffusent bien VR = Vo + VP f . Si f=0 molécules totalement exclues VR = Vo f=1 Si f=1 molécules incluses VR = Vo + VP Volume de diffusion totale Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

10. VR VT forte inclusion Si K 1 ceci signifie VR = Vo + VP f . K . D’autres phénomènes que l’exclusion Adsorption ou Échange ionique Cas des substance aromatiques avec les gels de dextarn Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

11. K .f (Vo-VR(= Vp Si K= O VR = Vo + VPf . K. Molécules complètement exclues Available accessible Kav = VR-VO Vp + VG VT = Vo + VP + VG VP + VG= VT - Vo Kav = Vp Vp + VG = Kav Vo-VR VT – Vo Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

12. f=0 f 1 f=1 1 2 Rs = ¼(a-1)/a . k2/(1+k2). N21/2 Efficacité de la colonne a = TR2– To La résolution Influence de la capacité To – 1TR La sélectivité Rétention relative Distribut° des 2 S -porosité du gel -taille des S -uniformité des f des pores La sélectivité Rétention relative Distribution 2 S -porosité du gel -taille des S -uniformité des f des pores Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

13. f=0 log PM Exclusion Domaine exploré Diffusion totale Inclusion f=1 k = K . Vs/VM Vs = f. Vp En chromato d’exclusion le K est tj voisin de 1 ; k entre 0,5 et 3 k = Vs/VM Vs volume des pores accessibles VM volume extragranulaire Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

14. Vp Vo Vs Rs = ¼(a-1)/a . k2/(1+k2). N21/2 Le R augmente en même temps que k Au delà de 5 à 10, la résolution ne varie pas H = L/N N = 16 (TR/ w)2 w Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

15. Aspects pratiques • Sur couche mince • colonne Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

16. Caractéristiques des Phase stat • Le f des pores (réticulation?) • La taille et la forme des particules • Petites • Sphériques • Granulométrie variable • L’inertie • L’affinité des gels pour les solutés • La consistance classique micomiètre 120 - micomiètre 40 micomiètre 80 - micomiètre 20 H performance Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

17. Différents supports La phase stationnaire Substrat du gel (phase dispersée) La phase dispersante le solvant Grains, bille ou perle calibrées différents polymères dextrane polyacrylamide agarose Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

18. Classification des gel d’exclusion Xérogels: - mous - semi rigides Dextran ; agarose ; polyacrylamide;poly-; polyvinyl; styrènes séphadex Sepharose BiogelA ultrogel Séphacryl Biogel ultrogel Styragel biobeads fractogel aérogels rigides Perles de verre Ou silice poreuse ne gonflent pas Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

19. Colonnes de dessalages de solutions protéiques, prêtes à l'emploi, rapides et économiques. En 3-4 minutes, les sels et molécules de poids moléculaire < 5 kDa sont éliminés Caractéristiques du gel 􀂝 Polymère poreux hydrophile : réduction au maximum des adsorptions non spécifiques 􀂝 Stabilité mécanique élevée : résistance à des pressions jusqu’à 7 bars 􀂝 Stable aux pH de 0 à 14 􀂝 Pas de rétraction ni de dilatation des billes quel que soit le tampon des colonnes TSK-Gel de chromatographie d’exclusion de tailles, aussi bien pour la GFC (Gel Filtration Chromatography) séparation de peptides, protéines et autres molécules solubles en milieux aqueux que pour la GPC (Gel Perméation Chromatography) séparation de polymères solubles en milieux organiques. Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012