Sperm Seçiminde Yeni Yöntemler ve ART Başarısına Etkisi

1. Sperm SeçimindeYeni Yöntemler veART Başarısına Etkisi Prof. Dr. Esat Orhon

2. Fertilizasyon kapasitesi olanspermi seçme yöntemleri • Konvansiyonel • Morfoloji • Yeni yöntemler • Intra cytoplasmic Morphologically Selected sperm Injection - IMSI • Magnetic-activated cell sorting - MACS • Hyaluronik Asit

3. IMSIIntra cytoplasmic Morphologically Selected sperm Injection • Altı subselluler organelin morfolojik değerlendirilmesi • Akrozom • Post akrozomal lamina • Boyun • Mitokondria • Kuyruk • Nükleus • Düz • Simetrik • Oval Bartoov B, Human Reprod, 2005

4. IMSI Small nuclear vacuoles Normal form Large nuclear vacuoles Large oval sperm cells Narrow postacrosomal region Partial acrosome

5. How to improve IVF-ICSI outcome by sperm selection Bartoov B, RBM Online, 2006

6. How to improve IVF-ICSI outcome by sperm selection X X Bartoov B, RBM Online, 2006

7. IMSIIntra cytoplasmic Morphologically Selected sperm Injection • Dezavantajları • Morfoloji her ne kadar bilinen en iyi seçim parametresi ise de, sperm vitalitesi, fertilizasyon kapasitesi ve DNA integritesi hakkında % 100 informasyon sağlayabilen bir parametre değildir • Morfolojik seçim kriterleri her ne kadar mükemmelliğe en yakın parametre olmakla birlikte, mükemmel değildir. • Ucuz değildir, laboratuarlara yeni ekipman maliyeti getirmektedir. • Avantajları • Günümüzde pratik uygulamada en yüksek başarıya ulaşmış sperm seçim parametresi morfolojidir • IMSI morfolojik kriterleri en yüksek detaylarıyla değerlendirebilir • IMSI ile seçilmiş spermler bilinen en iyi parametre olan morfolojinin en yüksek isabetle uygulanabilmesini sağlar.

8. Magnetic-activated cell sorting - MACS • Apoptozis veya cryopreservation – thaw sonrasında hasarlanan spermler fertilizasyon ve implantasyon oranlarını olumsuz etkiler • Apoptotik veya hasarlı spermler ile normal ve fertil spermleri görünüşleriyle (morfolojileriyle) ayırd etmek mümkün olmayabilir • Apopototik özellikler taşıyan spermler normal görünüm verebilirler ve ICSI için seçildiklerinde olumsuz veya düşük başarı oranlarına yol açacaktır.

9. Normal ve apoptotik spermlerin plasma membranı altında phosphatidylserine (PS) rezidüleri vardır • Apoptozis sonrasında plazma membranı degrade olacağı için PS rezidüleri eksternalize olurlar PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS

10. annexin V Magnetic-activated cell sorting - MACS annexin V ile konjüge manyetik işaretlenmiş mikro kürecikler annexin V PS PS PS PS PS PS ~ 50 nm PS PS PS PS PS

11. annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V Magnetic-activated cell sorting - MACS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS annexin V ile konjüge manyetik işaretlenmiş mikro kürecikler apoptotik spermlerden eksternalize olmuş PS ile bağlanırlar

12. Magnetic-activated cell sorting - MACS Böylece apoptotik spermler manyetik hale gelirler ve manyetik bir alana girdiklerinde bir kutuba doğru çekilirler Plazma membranı degrade olmamış normal spermlerin PS rezidüleri yoktur veya varsa bile hücre içinde kalmışlardır Bu nedenle annexin V ile konjüge manyetik küreciklerle bağlanmazlar ve manyetik alandan etkilenmeden serbest hareket edebilirler.

13. Mıknatıs Mıknatıs PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS PS annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V annexin V

14. Magnetic-activated cell sorting - MACS

15. MACS • Apopitotik sperm izolasyonu • Genomik bütünlüğü tam sperm seçimi • Kaliteli sperm seçimi • Düzelmiş sperm fertilizasyon potansiyeli • Yüksek oosit penetrasyon kapasitesi Tamer S, J Andrology, 2008

16. Magnetic-activated cell sorting - MACS • Avantajları • Morfolojik seçim kriterlerinin bir adım ötesine geçmiş bir yöntemdir • Vitalite ve membran bütünlüğü gibi hayati önemi olan özellikleri belirlemede başarılıdır • Çok kısa sürede sonuç alınabilen pratik bir yöntemdir. • Dezavantajları • Yeni bir yöntemdir, henüz yaygın kabul gördüğü söylenemez • Yazarlar tarafından pratik bir yöntem olduğu iddia edilse de, laboratuarlara yeni ekipman maliyeti getirecektir • MACS yöntemi ile seçilmiş spermlerle elde edilen gebeliklerin güvenli olacağına dair henüz yeterli çalışmalar yoktur.

17. Hyaluronic Acid - HA • Daha önce creatine kinase M isoform olarak bilinen HspA2, testislerde üretilen bir proteindir • HspA2, sperm matüritesi, sperm fonksiyonları ve fertilizasyon kapasitesinin önemli bir göstergesidir • Sinaptonemal kompleksteki HspA2 varlığı, kromozomal anöploidilerde ve maturasyon arresti olan spermlerde düşük düzeyde kalır.

18. Hyaluronic Acid - HA • HspA2 aktivitesi aynı zamanda elongating spermatidler ve spermatogenetik matürasyonla da yakın ilişkilidir • Örneğin, sperm plasma membran remodelling, zona pellucida formasyonu ve HA bağlanma bölgeleri ile de yakın ilişkisi vardır.

19. Hyaluronic Acid - HA • HA-coated slidelar veya petri kapları kullandığında, matür spermlerdeki HA reseptörleri belirgin bağlanma gösterirler • Böylece matür sermlerin diğerlerinden ayırd edilebilmesi ve ICSI için seçilebilmeleri sağlanır.

20. Hyaluronic Acid - HA • HA-selected spermlerde anöploidiler 4-6 kat daha az izlenir • ICSI bebeklerinde görülebilecek kromozomal aberasyonlarda da azalma sağlanır.

21. Hyaluronic Acid - HA • Sperm morfolojisi ve kromozom problarıyla yapılan kombine çalışmalar, morfolojinin sağlıklı haploid sperm seçiminde yeterli olmadığını ortaya koymuştur • HA-sperm seleksiyonu, morfolojik seçim parametrelerinden iki adım öne geçmiş olarak kabul edilebilir.

22. HspA2 HspA2 : Sperm sellular maturite (Mayotik proses) Fertilizasyon potansiyeli Huszar G, Biology Reprod, 2000

23. Plasma membranının matürasyonu (remodelling) sırasında, elongating spermlerde belirgin olmayan HA bağlanma bölgeleri, matür spermlerde belirginleşir.

24. Viable spermler ve HA bağlanması Soldaki resimde, viable ve non-viabe spermlerin bir arada olduğu görülüyor Sağdaki resimde, sadece HA-bağlanmış viable spermlerin varlığı izleniyor.

25. Viable spermler ve HA bağlanması HA-bağlanmış matür spermlerde creatinine kinase içerikli sitoplazmik retansiyonlar, persistan histonlar ve DNA fragmantasyonları daha az oranda izlenir. Üst sıradaki resimlerde, bu özelliklerin çeşitli düzeylerdeki varlığı izleniyor Alt sıradaki resimlerde, HA bağlanmış viable spermlerin daha temiz görüntü veren paternleri izleniyor.

26. ICSI için Matür Viable Spermatazoa seçimi Soldaki resimde HA-coated bir slide üzerindeki spermler izleniyor Küme şeklinde toplanan spermler HA-bağlanmış viable spermler olup, halen kuyruk motiliteierini de sürdürmektedirler Kümenin dışında serbest yüzen spermler, HA-bağlanmayan matürasyon arresti olan spermlerdir Sağdaki resimde HA-bağlanmayan matürasyon arrestli spermler yıkanarak uzaklaştırıldığında, ortamda sadece matür spermler kalır ve ICS için seçilebilirler.

27. HA seçimli spermlerin anöploidi frekansları

28. HA-ICSI Klinik sonuçlar Parmegiani L, Fertility Sterility, Article in Press, 2009

29. Hyaluronic Acid – HA Sperm Seçimi • Avantajları • Sperm seçiminde morfolojik kriterlerin iki adım daha önüne geçmiş fonksiyonel bir testtir • Fizyolojiktir. Zona pellucida’nın sperm seçimine benzer bir mekanizması vardır • Pratik ve hızlı sonuç veren bir yöntemdir. • Dezavantajları • ?

30. İran Şahı Rıza Pehlevi, İran tahtına varis olacak erkek çocuk doğuramadığı için Prenses Süreyya’yı boşadı

31. Şebnem Kısaparmak Paylaştıkça Urfalı ………..

33. Studies on sperm antigenicity Marcus et al European Journal of Immunology