Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (a livello DNA/RNA)

1. Molti composti possono essere ottenuti da culture batteriche. In passato la lista era limitata a quei composti naturalmente sintetizzati dai microorganismi… L’applicazione del gene cloning ha permesso di produrre composti chimici e proteine non prodotte naturalmente dal microorganismo in organismi ospiti, così dette proteine ricombinanti

3. Criteri fondamentali per la produzione di proteine • Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del • gene di interesse (a livello DNA/RNA) • La proteina prodotta deve mantenere la propria • attività biologica (livello struttura/conformazione della proteina) • La proteina deve essere facilmente re-isolata dal • rimanente materiale cellulare

7. modificazioni post-traduzionali (MPT)

11. GLI STEP FONDAMENTALI DELL’ESPRESSIONE DI UN GENE

12. Vettori per l’espressione di geni “estranei” in E. coli Se un gene non-batterico è legato a un vettore standard e trasformato in E. coli non si produce significative quantità di proteina ricombinante. Perché? • Ci sono corte sequenze specifiche di DNA che sono riconosciute dal batterio per avvertire la presenza di un gene e dare quindi istruzioni all’apparato di trascrizione e traslazione della cellula. COSTRUIRE UN VETTORE D’ESPRESSIONE SIGNIFICA ESSENZIALMENTE COSTRUIRE UN VETTORE DI REPLICAZIONE CONTENENTE TUTTI QUEI SEGNALI CAPACI DI OTTIMIZZARE LA CORRETTA TRASCRIZIONE E TRADUZIONE DEI GENI ETEROLOGHI NELL’OSPITE IN CUI AVVIENE L’ESPRESSIONE. PER AUMENTARE LE RESE, INFINE, IN GENERE SI CERCA DI OTTIMIZZARE LA STABILITA’ DEI PRODOTTI DI ESPRESSIONE, SIA A LIVELLO TRASCRIZIONALE CHE TRADUZIONALE.

13. Tre sono i segnali importanti per i geni del E. coli : • Il promoter, che identifica il punto di inizio della trascrizione del gene. Nel E. coli il promoter è riconosciuto dalla subunità sigma dell’enzima RNA polimerasi. • Il terminator, che identifica la fine del gene da trascrivere. • Il ribosome binding site, una corta sequenza di basi riconosciuta dal ribosoma come punto di attacco alla molecola di mRNA. Il codone di inizio del gene è sempre pochi nucleotidi downstream di questo sito. Nei batteri è costituita da una sequenza, chiamata SHINE-DALGARNO (SD), complementare al 3’ del rRNA 16S presente nella subunità ribosomale piccola 30S. La sua sequenza consenso è: 5’-UAAGGAGG-3’

14. PROMOTER E. coli RNA polimerasi non si attacca a promoter umano perché le sequenze promoter sono diverse e quindi il gene non viene trascritto Soluzione: inserire il gene in un vettore sotto il controllo di un set di segnali di espressione tipici del E. coli. Veicoli di cloning che hanno questi segnali sono usati per esprimere proteine ricombinanti e sono chiamati vettori di espressione

15. Promotore/operatore BamHI Terminatore Shine-Dalgarno Ap ori UAA (stop codon) AUG (start codon) RBS mRNA 5’ 3’ La spaziatura ottimale tra RBS e AUG è di 8 bp

16. ORIGINE DI REPLICAZIONE • Il tipo di Origine di replicazione determina il numero di copie del plasmide nella cellula • Le origini di replicazione più utilizzate nei plasmidi di espressione di proteine ricombinanti derivano da alcune famiglie di plasmidi: pBR322 15-20 copie/cellula pUC 500-700 copie/cellula pACYC184 10-12 copie/cellula Non c’è correlazione tra numero di copie del plasmide e quantità di proteina espressa, in generale plasmidi ad alto numero di copie con promotori molto forti diminuiscono la vitalità cellulare.

17. LA SCELTA DEL PROMOTER Il promoter è la componente più importante di un vettore di espressione perché controlla la velocità di espressione del mRNA Strong promoters sono quelli che determinano alta velocità di trascrizione e quindi controllano geni che sono richiesti in larga quantità nella cellula Weakpromoters regolano geni necessari in minore quantità all’interno della cellula e quindi non sono usati nei vettori di espressione UN PROMOTORE PROCARIOTICO TIPICO E’ COSTITUITO DA CIRCA 60 bp CONTENENTI DUE SEQUENZE CONSENSO A -35 (ttgaga) e -10 (tataat). LA SPAZIATURA IDEALE TRA -35 e -10 VARIA TRA 16 a 17 bp . QUELLA TRA -10 E ATG E’ DI 9 bp.

18. LA SCELTA DEL PROMOTER Un altro fattore importante da considerare per costruire un vettore di espressione è capire come regolare il promoter: la regolazione del promoter • Due tipi di regolazioni dei geni sono riconosciute nel E. coli: • Induzione: la trascrizione del gene è “accesa” con l’addizione di un composto chimico nel mezzo di cultura • Repressione: la trascrizione del gene è “spenta” con l’aggiunta di un prodotto chimico regolatore

19. Perchè i vettori d’espressione sono (quasi) sempre regolati nella espressione proteica? • L’espressione di una proteina eterologa tende ad essere identificata come “estranea” e degradata dalla cellula che attiva specifiche proteasi. La possibilità di indurre l’espressione della proteina permette di minimizzare le degradazioni proteolitiche aumentando le rese. • Alcune proteine possono essere tossiche o, comunque, interferire con la crescita dell’ • ospite di espressione. In alcuni casi fino al 50% delle proteine totali sono costituite dalla proteina ricombinante, a discapito delle proteine che assicurano il normale metabolismo di E.coli. • La possibilità di limitare l’espressione della proteina alla sola fase di induzione permette il normale sviluppo della cellula. • La possibilità, di indurre sperimentalmente l’espressione della proteina rappresenta un • primo strumento di verifica dei livelli di espressione; comparando un estratto proteico • indotto con uno non indotto si riesce facilmente ad evidenziare la presenza della • proteina eterologa putativa (di cui conosciamo il peso molecolare)

20. Un vettore di espressione DEVE contenere le sequenze di promoter opportune per “accendere” l’espressione del gene • Esempi di promoter usati nei vettori di espressione: • lac promoter, indotto dal IPTG=isopropil-tiogalactopiranoside • trp promoter, indotto da acido 3-b-indolacrilico e represso dal triptofano • tac promoter, indotto da IPTG • lPL promoter, responsabile per la trascrizione della molecola l DNA

21. Regolazione dell’espressione proteica La sintesi di una proteina può essere regolata dalla presenza di un gene regolatore gene regolatore siti di controllo gene strutturale o p i z Il gene regolatore i produce un repressore, una proteina, che puo’ interagire con l’operatore o, un segmento di DNA adiacente al gene strutturale, e inibisce la trascrizione del gene strutturale. Il sito p è il promotore, ossia il sito di attacco dell’RNA polimerasi gene regolatore siti di controllo gene strutturale p i o z La proteina repressore si lega all’operatore e impedisce la trascrizione dei geni strutturali mRNA i repressore

22. gene regolatore siti di controllo gene strutturale p o i z Regolazione dell’espressione proteica mRNA z mRNA i proteina z repressore Un’induttore come l’IPTG (isopropil--D-tiogalattopiranoside) si lega al repressore, impedendogli di interagire con il sito operatore. In questo modo i geni strutturali possono essere trascritti

24. PROMOTORE

25. Circa il 90% delle proteine presenti nel PDB sono state espresse in plasmidi pET sotto il controllo del promotore T7/lac Altri promotori molto utilizzati sono: induzione: araBAD Arabinosio cspA bassa temperatura (<20°C) tetA tetraciclina/anidrotetraciclina cadA pH acido

26. SISTEMA T7/Lac La proteina ricombinante è sotto il controllo del promotore T7 (derivato dal fago T7) e viene trascritta solamente dalla T7 RNA polimerasi La trascrizione della T7 RNA polimerasiè controllata dall’operatore lac, isolato dall’operone lac: Regolazione della trascrizione nell’operone lac:

27. SISTEMA T7/Lac La proteina deve essere espressa in ceppi di E. coli lisogeni del fago DE3, ingegnerizzati per esprimere la T7 RNA polimerasi Sistema pET: il gene target è sotto il controllo del promotore della RNA polimerasi fagica T7, il quale è regolato negativamente dall’operatore lac; sul plasmide è presente il gene lacI codificante per il repressore lac. Le cellule batteriche utilizzate per l’espressione sono cellule di Escherichia coli, ceppo BL21, che presentano una copia cromosomale del gene per la RNA polimerasi T7 sotto il controllo del promotore lacUV5 insensibile alla inibizione da glucosio ed inducibile da lattosio o da analoghi come l’isopropyl--D-tiogalattopiranoside (IPTG).

28. SISTEMA T7/Lac In caso di espressione basale di proteina ricombinante (in assenza di IPTG), si possono usare ceppi di E. coli che esprimono il lisozima T7, codificato dai plasmidi pLysS o pLysE