1 / 19

Bioseparasi Papain sebagai bahan baku obat

Bioseparasi Papain sebagai bahan baku obat. Kelompok 10 Raditya Rainer C Yongki Republik. Isolasi Papain. Getah pepaya dikumpulkan dengan konvensional digunakan sebagai bahan baku utama papain. Bahan. Pohon pepaya lokal

kelii
Download Presentation

Bioseparasi Papain sebagai bahan baku obat

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. BioseparasiPapainsebagaibahanbakuobat Kelompok 10 Raditya Rainer C Yongki Republik

  2. IsolasiPapain • Getahpepayadikumpulkandengankonvensionaldigunakansebagaibahanbakuutamapapain

  3. Bahan • Pohonpepayalokal • Standard papain, polyacrylamide, bis-acrylamide, ammonium persulfate and PEG 6000 Sigma–Aldrich (St. Louis, USA), • Casien (Hammarsten) BDH (Poole, Eng-land).

  4. IsolasiGetah • Latex ataugetahdiisolasidaripohonpepaya • Getahdikumpulkandenganperangkat yang terpasangpadabatangpohon • Getahdisimpandalambotolplastikpadasuhu -200C

  5. PurifikasiPapain • Salt precipitation (pengendapangaram) 2 tahap • Aqueous two-phase system (sistemduafase)

  6. Salt precipitation 1 • Getahdicampurdengancysteindenganperbandingan 3:1 (w/v) disuspensidengan 6M HClsamapi pH 5.6 dandiadukdenganstirer 15 menitpada 40C • Hasillarutanditambahkan 6M NaOHsampai pH 9 • Zat yang tidaklarutdihilangkandengansentrifugasi 9000 g 30 menit, 40C • Supernatant diambilditentukankandungan protein

  7. Salt precipitation 2 • Supernatandinetralkandenganpenambahan air • Pengendapandenganmenambahkan (NH4)2SO4kemudiandiadukdengan stirrer padasuhu 40C selama 30 menit • Sentrifugasi 9000 g 30 menit, 40C • Pesipitatdiambilditambahkan 20mM cystein • Larutandijaga 40C kemudianditambahkan 10%NaOH (w/v) distirrerselama 30 menit • Sentrifugasiuntukmemisahkanpadatanpapain • Padatandilarutkandalam air dandidialisispada 40C dengantiga kali pergantian air (1 L) • Endapan yang didapatkanberupaenzimpapain, dilyophilized (freeze –dryer) makadidapatkan powder papain

  8. Salt precipitation

  9. Extraction in aqueous two-phase system • Getahdicampurdengan air dan pH diaturdengan 6M HCl. • Ekstraksiduafasediperlukanpenambahan PEG (PolietilenGlikol) dan (NH4)2SO4padagetah ( 30 grgetah) • Hasilpencampuranditambahkan air sampaidengan 50 gr, pH diaturdenganmenambahakan 6M HClatau 6 M NaOH • Larutandiadukselama 15 menitdenganperlahan. • Keduafase yang terbentukdipisahkandengansentrifugasi 9000 g selama 30 menitpada 40C • Aliquot diambiluntukdianalisis protein danaktifitas protease. • Keberadaanpapaindalamfraksiditentukandengananalisis gel elektrophoresiskatodedan FPLC

  10. Extraction in aqueous two-phase system • Analisisdengan FPLC, fraksiatassebanyak 6 ml darilarutandidialisistiga kali pada 40C dengan 50 mM sodium asetat buffer pH 5 • PEG dipisahakandarilarutandenganChromatografi ion-exchange • Larutandimasukandalamkolom CM-selulosa (1.5 cm x 2cm) diequiliberasidengan 50 mMasetat buffer pH 5 • Enzimdielusidarikolomdengan buffer NaCl 1 M • Papainsebagaianbesarterelusididepankedua buffer • Fraksiinidikumpulkan, didialisisdanlyophilized (freeze dryer) didapatkan powder papain

  11. Aqueous two-phase system

  12. Analisiskemurniandengan Fast Protein Liquid Chromatography • 25 µl larutanpapaindalam 20 mMglycine-NaOH buffer digunakandidalamkolom Mono Q HR 5/5 (1 ml) yang dicucidengan 5 ml buffer yang sama • Papaindan protein lainnyaterelusiolehgradien linear sodium kloridadari 0 – 0,5 M (total volume 24 ml) denganlaju 1,0 ml/min • Fraksi 1 ml diambildandiplotkromatografi A280 dankomposisigradienvs volume elusidirecord • Peak elusidaripapainditentukanmenggunakanpapainstandar • Persentaseluas peak papaindidapatkandari automatic integrator • Kemurnianpapaindiketahuidaripersentaseluas peak papainberbandingluas peak total

  13. Analisisaktifitasenzimpapain • 100 µl larutanenzimdipreparasidahuludengandicampurkan 200 µl 50 mM cysteine-20 mM EDTA dan 700 µl 50 mMTris-HCl buffer pada pH 8 • Campurantersebutdiinkubasiselama 5 menitpadasuhu 37°C direaksikandengan 1 ml 1% (w/v) larutan casein • Setelah 10 menit, reaksidihentikandenganmenambahkan 3 ml 5% (v/v) trichloroacetic acid (TCA) padalarutantersebutdandidinginkanselama 1 jam • Campuranitukemudiandisentrifugasidandiambilsupernatannyauntukdiukurabsorbansinyapada 275 nm • Satuan unit aktifitas protease tersebutdiukurberdasarkanjumlahenzim yang memberikanprodukdigestiterlarut yang menghasilkankenaikanabsorbansipada 275 nm setaradengan 1 µmol dari tyrosine/min padakondisipercobaan

  14. Papain assayGel Elektrophoresiskatode-polyacryamide StandarPapain Crude Latex Salt precipitate 4. Fraksiatas 2 phase aqueous 5. Fraksibawah Bottom

  15. Salt precipitation

  16. Aqueous two-phase system

  17. HasilPapain • Papainmurnididapatkanpadafaseatas FPLC dengan 1/4 volume darikeseluruhan • Optimal precipitation dan two phase sistempurity (100% versus ∼89%)dari papaya latex.

  18. FPLC

  19. EstimasiKasarEkonomiAnalisis • HargaperalatanAnalisis • FPLC : $3500 • Gel Elektrophoresiskatode-polyacryamide : $2500 • Hargapapain 37.5 euro/ 225 gr

More Related