ZÁSADY ODB Ě RU A TRANSPORTU BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU

1. ZÁSADY ODBĚRU A TRANSPORTU BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU

2. Jedním ze základních pilířů oboru mikrobiologie je správný odběr materiálu k mikrobiologickému vyšetření. • Adekvátní klinický materiál, jeho následné vyšetření podle zásad správné laboratorní praxe a v neposlední řadě jeho odpovídající klinická interpretace je důležitým zdrojem diferenciální diagnostiky a vhodného léčebného přístupu k pacientovi.  

3. Je nutné zdůraznit, že lékařská mikrobiologie není jen laboratorním oborem, ale i oborem, který je schopen aplikovat své výsledky do klinické praxe. • Mikrobiologické vyšetření ale není pouze laboratorní záležitostí. • Jeho prvopočátkem je odběr biologického materiálu, který je v rukou klinických pracovníků. • Správně indikovaný a provedený odběr je základním předpokladem úspěchu mikrobiologického vyšetření. • Na něj navazuje transport odebraného materiálu do laboratoře a vlastní mikrobiologické vyšetření. • Každá z těchto tří složek má svoje specifika a je pro celkový úspěch stejně důležitá.

4. Mikrobiologické metody • Odběr materiálu a mikrobiologické vyšetřovací metody spolu velmi úzce souvisí. • Vyšetřovací metody jsou v tomto vztahu prioritní a většinou určují způsob odběru. • Obecně lze mikrobiologické metody rozdělit na přímé a nepřímé.

5. Přímé mikrobiologické metody • průkaz živého či mrtvého mikrobiálního původce, jeho částí, povrchových struktur, charakteristických látek jako jsou nukleové kyseliny, enzymy, toxiny a event. produkty metabolismu.

6. Přímé metody se dále dělí na: Mikroskopické • zobrazení původce mikroskopem optickým (různé druhybarvení) nebo elektronovým. • Jsou velmi rychlé, většinou ale s nízkou senzitivitou i specifitou. • Lze je velmi dobře využít pro průkaz obtížně kultivovatelných patogenů, vyskytujících se v dostatečné kvantitě ve vzorku materiálu (např. anaerobní bakterie) a k získání dalších informací (např. zánětlivá reakce, poměrné zastoupení infekčních agens).

7. Kultivační • pomnožení původce ve vhodných kultivačních půdách nebo tkáňových kulturách do množství způsobujících makroskopicky zřetelné projevy. • Dostatečně senzitivní a specifické, většinou, ale pomalé.

8. Imunochemické • detekce původce na základě reakce antigenu se specifickou protilátkou. Jako antigen se mohou uplatňovat jak somatické struktury, tak i exogenní produkty (např. toxiny Clostridium difficile). • Reakce je viditelná makroskopicky (např. aglutinace, latexová aglutinace) nebo je detekována dalšími reakcemi (např. imunofluorescence, barevná enzymatická reakce – ELISA). • Většinou vysoce senzitivní i specifické, rychlé, v bakteriologii ale omezeně využitelné.

9. Genetické • průkaz DNA nebo RNA bakteriálního původce hybridizací nebo dnes nejčastěji různými druhy amplifikačních metod. • Vysoce senzitivní, specifické i rychlé, zatím omezeně využitelné.

10. Chemické • průkaz chemických látek charakteristických pro detekovaný mikroorganismus. • Buď se jedná o součásti jejich těl (např. mastné a mykolové kyseliny) nebo produkty metabolismu (např. průkaz urey u gastroenteritid způsobených Helicobacter pylori). • Senzitivní, specifické i rychlé metody, jejich využití je rovněž omezené. Až na výjimky vyžadují náročné přístrojové vybavení (plynové chromatografy, hmotnostní spektrometry).

11. Pokus na zvířeti • V současné době je pro rutinní diagnostiku využíván velmi málo. • Jeho použití je vázáno na dodržování přísných předpisů o ochraně zvířat proti týrání.

12. Nepřímédetekcereakcí makroorganismu na působení mikrobiálního původce • Ve většině případů se jedná o stanovení protilátek různých tříd. • K tomuto účelu se používá široká škála metod od prosté aglutinace, aglutinace na nosičích, komplement-fixační reakce až po imunochemické metody, z nichž jsou nejrozšířenější metody ELISA. • Nepřímý (serologický) průkaz původce se používá především tam, kde je kultivační průkaz obtížný nebo zcela nemožný – nejčastěji ve virologii a parazitologii.

13. Odběr materiálu - základní principy správnéhoodběru • Čas • u infekcí způsobených mikroorganismy je velice důležité správně načasovat odběr materiálu k mikrobiologickému vyšetření. • Místo odběru materiálu • souvisí s druhem infekčního procesu a jeho průběhem. Zde se nejvíce projeví erudice a zkušenosti ošetřujícího zdravotnického personálu. Správný odběr musí být proveden lege artis a asepticky – za sterilních kautel.

14. V případě bakteriálních infekcí je velmi vhodné odebrat relevantní materiál ke kultivaci ještě před zahájením aplikace antimikrobních přípravků. • Dalším důležitým biologickým materiálem je krev, kterou je nutné odebrat opakovaně (aspoň 2-3 hemokultury) a to jak pro aerobní, tak anaerobní kultivaci.

15. Hemokultivace - doba odběru Obecné pravidlo odebrat krev co nejdříve po prvních klinických příznacích Více odběrů rozložit v čase zvětšení pravděpodobnosti zachycení bakterií

16. Správné načasování odběru • U pacientek s intermitentní bakteriemií na začátku vzestupu teplotní křivky, popřípadě 1 hod. před jejím začátkem. Další 2 - 3 hemokultury je vhodné odebrat v 30-minutových intervalech. • U pacientek s kontinuální bakteriemií se odebírají 3 - 4 vzorky v 15 – 30minutových intervalech nebo bezprostředně před podáním antimikrobního léčiva, pokud je již aplikován. • Při negativním výsledku opakovat hemokultury v následujících dnech.

17. V případech pacientů s již aplikovanými antimikrobními přípravky je vhodné odebrat krev před jejich podáním a použít hemokultur s inhibitory antibiotik. • Jako vhodné systémy pro kultivaci krve se jeví především automatizované hemokultivační systémy, pracující na principu detekce zplodin bakteriálního metabolismu.

18. Dezinfekce Místo vpichu70% alkohol (odmaštění) jodové desinfekční prostředky nepoužívat kvarterní amonné soli (ajatin) ! Stěr z místa vpichu !?! Hemokultivační lahvička propichovací zátka 70% alkohol !!! Nepoužívat jodové desinfekční prostředky u lahviček do automatických systémů - negativně ovlivňuje detekci CO2 !!!

19. Transportní souprava – musí splňovat následující základní požadavky: • umožnit odběr vzorku, • zajistit přežívání mikroorganismů do doby, než dojde ke zpracování vzorku v mikrobiologické laboratoři, • ochránit vzorek před vnější kontaminací, • ochránit vnější prostředí před kontaminací vzorkem, • jednoznačná identifikace vzorku a přenos nezbytných dat,většinou jsou tyto požadavky řešeny průvodkou v papírové podobě, může být i elektronický přenos dat.

20. Materiál odebíraný ke kultivačnímu vyšetření lze rozdělit do tří základních skupin:

21. Tekutý materiál - moč, krev, likvor, hnis, sputum a další tělesné tekutiny či tkáně v tekutém stavu. • Odebírají se do sterilní nádoby v dostatečném množství (min. 0,5–1 ml). • Velmi důležité je, aby použitá nádoba dobře těsnila a nemohlo dojít ke kontaminaci materiálu či naopak okolí a zdravotnického personálu. • Pro některé tekutiny (např. moč, krev) jsou speciální nádoby s kultivační půdou.

22. Tuhý materiál - tkáně, stolice atd. • Pro odběr platí stejná pravidla jako pro tekutý materiál.

23. Výtěry • Slouží k odběru malého množství materiálu nebo tam, kde není možné odebrat materiál jiným způsobem. • Základní výtěrovkou je sterilní špejle nebo drát na jehož konci je namotán chomáček vaty, která může být nasycena aktivním uhlím. • Výtěrovka je uchovávána v plastové zkumavce nebo plastovém obalu. Před odběrem je vhodné namočit vatový konec ve sterilním fyziologickém roztoku, aby se zabránilo vyschnutí a odumření zachycených bakterií během transportu do laboratoře. • Sice dražší, ale z hlediska záchytu bakterií výhodnější, jsou výtěrovky s transportním kultivačním polotuhým médiem. Tyto výtěrovky není nutné před použitím zvlhčovat a kultivační půda zlepšuje možnosti přežití transportu u většiny citlivých a kultivačně náročných bakterií.

24. Odběr materiálu k sérologickému vyšetření • Pro sérologická vyšetření se odebírá 5-10 ml plné (srážlivé) krve, která se v laboratoři centrifuguje. • Vlastní stanovení protilátek se provádí ze séra. • Pro sérologickou diagnostiku infekčních onemocnění je velmi důležité sledovat dynamiku titru protilátek. • Je tedy nutné odebírat dva vzorky, druhý s časovým odstupem 1-3 týdnů.

25. Základní principy odběru biologického materiálu k mikrobiologickému vyšetření lze definovat následujícími body: • Na základě znalosti povahy a průběhu infekčního procesu odebrat právě ten materiál, v němž se infekční agens nalézá a lze ho nejsnáze prokázat. • Správná technika odběru vhodnými nástroji a do vhodných odběrových nádob. • Sterilní způsob odběru, aby nedošlo ke kontaminaci odebíraného vzorku. • Odebírat materiál pokud možno před podáním antibiotik. Jestliže léčba již byla zahájena, je nutno na tuto skutečnost laboratoř upozornit. • Opakovat odběr v případech, kdy jednorázové vyšetření neposkytuje záruku záchytu mikroba nebo dostatečnou možnost závěrečné diagnózy. Platí to zejména pro vyšetření sérologická, ale mnohdy také pro přímý průkaz infekčního agens.

26. Transport materiálu • Obecně platí, že transport materiálu ke kultivačnímu vyšetření má být co nejrychlejší. Každá prodleva zmenšuje možnost diagnostiky, zejména v případě růstově náročných bakterií. • Relativně nejlépe vydrží mikrorganismy podmínky a dobu transportu v tekutém materiálu a v hemokulturách. Hůře je na tom tuhý materiál a tkáně, které osychají. Tomu se dá zabránit transportem ve fyziologickém roztoku, což může vést při malých počtech bakterií k jejich vyplavení a falešně negativní mikroskopii. • Nejvíce citlivé na dobu transportu jsou výtěrovky bez transportního média.

27. Většina bakterií podílejících se na patogenních procesech u člověka snáší bez problémů teplotu 4–8 C. Snížení teploty zpomalí jejich metabolické procesy a bakterie lépe vydrží nepříznivé podmínky. • Bohužel, některé důležité patogeny jako například Neisseria gonorrhoeae nebo Neisseria meningitidis mohou již při této teplotě hynout. • Naopak vyšší teplota (25–30 C) může v prostředí s dostatkem živin způsobit přemnožení některých bakterií, které jsou součástí běžné flóry a potlačení patogenních původců (např. koliformní tyčinky potlačí -hemolytické streptokoky). 

28. Moč – vzhledem k většinou snadné dostupnosti tohoto materiálu by jakékoliv skladování nemělo připadat v úvahu. Při transportu je nutné udržet pokud možno nízkou teplotu. V moči mohou být i fyziologicky přítomné bakterie a moč představuje dobrou kultivační půdu (může obsahovat glukosu a bílkoviny). Při vyšší teplotě (např. v letních měsících) dochází už během dvou hodin k pomnožení event. fyziologicky přítomných bakterií na vysoké kvantity a k falešně pozitivním výsledkům.

29. Hnis, putridní materiál, nekrotické tkáně – uchovávat při teplotě 4–8 C. Event. přítomné koliformní bakterie mohou být při vyšší teplotě příčinou kvasných procesů s tvorbou plynu a způsobit porušení obalu a kontaminaci jak odebraného materiálu, tak i okolí tímto materiálem. • Stolice - uchovávat při teplotě 4–8 C z důvodu velmi vysokého rizika kvasných procesů a výše uvedených následků.

30. Výtěrovky bez transportního média – jakékoliv skladování podstatným způsobem snižuje pravděpodobnost záchytu původce. Doba od odběru materiálu do zpracování v laboratoři by neměla přesáhnout dvě hodiny. • Výtěrovky s transportním médiem – transportní medium umožňuje přežívání většiny bakterií, uplatňujících se v patogenezi bakteriálních infekcí, v závislosti na jejich odolnosti a růstových vlastnostech. V každém případě by doba skladování a transportu neměla přesáhnout 24 hodin.

31. Klinický materiál Podmínky transportu Výtěr tamponem bez transportního média Jakékoliv skladování snižuje pravděpodobnost záchytu původce. Doba transportu by neměla přesáhnout 2 hodiny při 4 oC. Výtěr tamponem s transportním médiem Transportní médium umožňuje přežívání většiny bakterií, zachovává i jejich původní kvantitativní poměry. Doba skladování a transportu by neměla přesáhnout 24 hodin při teplotě 4 °C. Moč Vzhledem k většinou snadné dostupnosti tohoto materiálu by jakékoliv skladování nemělo připadat v úvahu (výjimečně až 18 hodin při 4 oC). I při transportu je nutné udržet nízkou teplotu. V moči mohou být v nízkém počtu přítomny bakterie bez klinického významu. Při vyšší teplotě (např. v letních měsících) dochází už během dvou hodin k jejich pomnožení na vysoké kvantity a k falešně pozitivním výsledkům (moč může obsahovat glukosu a bílkoviny, proto představuje dobrou kultivační půdu).

32. Sputum Nutný rychlý transport. Uchováváním při 4 oC by mohlo dojít k úhynu náročnějších bakterií, při vyšších teplotách k nežádoucímu pomnožení kontaminující ústní mikroflóry a zkreslení kvantitativních poměrů. Hemokultura U lahviček do automatických systémů Bactec a BacT/Alert výrobci garantují možnost 24h inkubace při pokojové teplotě před vložením inokulované lahvičky do přístroje. Nízká teplota je v těchto případech nevhodná – prodlužuje dobu následné kultivace a tím i čas detekce pozitivního vzorku. Likvor Vzhledem k důležitosti tohoto materiálu je nutný co nejrychlejší transport do mikrobiologické laboratoře a jeho okamžité zpracování. Pokud nelze transport realizovat okamžitě, je možné ho inokulovat do lahvičky pro hemokulturu a ponechat při pokojové teplotě. Hnis, punktát, bioptický materiál Uchovávat při teplotě 4 °C. Přítomné bakterie mohou být při vyšší teplotě příčinou kvasných procesů s  tvorbou plynu a způsobit porušení obalu. Stolice Uchovávat při teplotě 4 °C z důvodu vysokého rizika kvasných reakcí.

33. Schéma časového průběhu mikrobiologického vyšetření