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人感染 H7N9 禽流感病毒标本采集、 保存、运送及检测

人感染 H7N9 禽流感病毒标本采集、 保存、运送及检测. 浙江省疾病预防控制中心. 标本保存和运输. 实验室检测. 禽 H7 病毒简介. 样本采集. 主要内容. 原始标本采集. 呼吸道病毒的诊断取决于高质量标本的采集，及其保存运输等环节。多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织。标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。. 标本采集人员 医疗机构的医生、护士或疾病预防控制中心专业人员负责标本采集并填写标本登记表，标本采集人员按照相关要求做好个人防护。. 采集前的准备.

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人感染 H7N9 禽流感病毒标本采集、 保存、运送及检测

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Presentation Transcript

  1. 人感染H7N9禽流感病毒标本采集、保存、运送及检测人感染H7N9禽流感病毒标本采集、保存、运送及检测 浙江省疾病预防控制中心

  2. 标本保存和运输 实验室检测 禽H7病毒简介 样本采集 主要内容

  3. 原始标本采集 呼吸道病毒的诊断取决于高质量标本的采集，及其保存运输等环节。多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织。标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。 标本采集人员 医疗机构的医生、护士或疾病预防控制中心专业人员负责标本采集并填写标本登记表，标本采集人员按照相关要求做好个人防护。

  4. 采集前的准备 • 个人防护设备（PPE） • 口罩 (N-95 or N/P/R-100) • 手套 • 帽子 • 鞋套 • 防护服 • 防护目镜

  5. 采集前的准备 • 采集物品包

  6. 采集前的准备 • 常用的采样液/病毒运输液(VTM） • pH 7.4～7.6的Hanks液 • MEM/DMEM液 • 在采样液中需加入抗菌素，可用青霉素（终浓度为100U/ml）、庆大霉素（终浓度为1mg/ml）和抗真菌药物（终浓度为2µg/ml）。 • 在无菌的带螺旋塑料管分装2-3ml采样液。最好储存在:–20℃,4℃可放48–96h,室温1–2天。 • 采样拭子：使用头部为聚酯纤维的病毒采样拭子（鼻及口咽型），铝或塑料做柄，不推荐棉拭子和木柄

  7. 采集对象 • 1.监测病例，同时具备以下4项条件的病例： • （1）发热(腋下体温≥38℃)； • （2）具有肺炎的影像学特征； • （3）发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细胞分类计 数减少； • （4）不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所致肺炎。 • 2.人感染H7N9禽流感疑似病例与确诊病例，定义参照《人感染H7N9禽流感诊疗方案（2013年第1版）》

  8. 标本种类 • 上呼吸道标本：咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液 • 下呼吸道标本：气管吸取物、肺洗液、肺组织标本 • 血清标本：发病7天内急性期血清和间隔2-4周的恢复期血清 • 如病人死亡，可采集组织标本：肺组织、气管、支气管组织等

  9. 标本种类 • 应当尽量采集病例发病早期的呼吸道标本（尤其是下呼吸道标本） • 症状出现后尽早采集 • 尽量在抗病毒药物使用前采集 • 血清标本应采集发病早期和恢复期双份血清；

  10. 标本采集 咽拭子 • 用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。 √ ×

  11. 标本采集 鼻拭子 • 将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

  12. 标本采集 鼻咽抽取物或气管抽取物 • 用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次（亦可用小孩导尿管接在50ml注射器上来替代收集器）

  13. 5.血清：采集5ml静脉血加入消毒试管中，离心分离血清，放入带螺旋盖管内， 于-20℃以下保存。 6.尸检组织：死亡后尽早解剖，采集肺组织、气管分泌物标本，置无菌容器中（50ml螺口塑料管）， 于-70℃以下保存。

  14. 标本保存和运输 实验室检测 禽H7病毒简介 样本采集 主要内容

  15. 标本保存 • 尽快运到实验室 • 24小时内可以检测的可以保存在4℃，超过24小时-70℃冻存。流感病毒在-20℃～-40℃时不稳定，故长期保存应在-70℃温度以下，不要冻存于-20℃，会降低流感病毒的检出率 • 避免反复冻融，冰上一周也比冻融一次要好 • 血清标本暂时存在可在4℃冰箱，长期保存于-20℃冰箱。

  16. 标本包装和运输 • 根据《人感染H7N9禽流感疫情防控方案（第一版）》规定，H7N9禽流感病毒实验室活动和样本运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理

  17. 标本包装和运输 • 标本必须放在密封的带螺旋盖的、耐低温的塑料管内，直接在塑料管上用油性记号笔写明编号、种类、姓名及采样日期，再放入塑料密封袋内，每袋装一份标本 • 同时将标本有关信息填入标本送检单 • 送检单应信息完整，放入另一塑料袋内，不能与标本放置一起

  18. 标本包装和运输 • 病毒培养物按照A类感染性物质进行包装； • 其他感染性物质按照B类包装运输； • 按照《可感染性人类的高致病性病原微生物菌(毒）种或样本运输管理规定》进行审批。

  19. 专用标本运送箱

  20. 标本保存和运输 实验室检测 禽H7病毒简介 样本采集 主要内容

  21. 人感染H7N9禽流感病毒 实验室检测

  22. 核酸检测流程 • 县级疾控中心和医疗机构需立即对呼吸道标本开展甲通用引物和H7、N9亚型的检测； • 根据检测结果进行样本运送 ； • 若检测结果为H7N9核酸检测阳性时，应立即将剩余的2份呼吸道相关原始标本分别送当地市级流感网络实验室和省级疾控中心流感参比实验室；

  23. 核酸检测流程 • 若检测结果为甲型通用阳性，H7N9阴性，送剩余的2份呼吸道相关原始标本送当地市级流感网络实验室进行其他流感病毒型别鉴定； • 市级流感网络实验室若不能分型或H5阳性标本应立即送省级疾控中心流感参比实验室； • 若检测结果全部阴性，将剩余的2份呼吸道相关原始标本送省级疾控中心进行SARS、新冠状等病原体检测；

  24. 血清标本检测 • 实验室将采集的血清标本送省级疾控中心开展病原体的抗体检测；

  25. 生物安全防护要求 • 必须在生物安全二级实验室（P2级实验室）开展原始样本分装和核酸提取等实验操作； • 实验人员应佩戴眼罩、N95及以上水平的口罩等防护装备。

  26. 核酸检测

  27. 从3个病例中分离到3株病毒 病毒分离 A/Shanghai/1/2013(H7N9) A/Shanghai/2/2013(H7N9) A/Anhui/1/2013(H7N9)

  28. 三株H7N9病毒为同一基因类型 序列测定 PB2 PB1 6个内部片段来源于H9N2 PA HA NP NA MP NS

  29. 序列特点 • 耐药性分析 对烷胺类药物是耐药的，即M2蛋白25-42位氨基酸发生S31N突变。 • HA连接肽分析 HA蛋白339位连接肽由单个（PKGRGLFG）碱性氨基酸组成，根据既往研究，具有这种序列特点的病毒对禽类呈低致病性。 • 受体结合位点及其它重要位点分析 Shanghai/1/2013的HA蛋白 226-228位氨基酸属于禽源受体结合位点（为QSG）。Shanghai/2/2013和Anhui/1/2013的HA蛋白 226-228位氨基酸受体结合位点（为LSG） • PB2蛋白627位氨基酸为K，提示致病性增强。 • NS1蛋白92位氨基酸为D，与禽流感病毒一致，而与人流感病毒不同。

  30. HA核酸同源性比较

  31. H7进化树 红色标记为本次病例 ●H7 人感染病例

  32. N9 进化树 红色标记为本次病例

  33. PB2进化树 红色标记为本次病例 ●H7 人感染病例

  34. 谢谢！ Thanks!

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