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ANÁLISES TOXICOLÓGICAS

INTRODUÇÃO AO PLANEJAMENTO DE ANÁLISES NOÇÕES PARA A PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS. ANÁLISES TOXICOLÓGICAS. Paula Christiane Soubhia Laboratório de Toxicologia Centro de Controle de Intoxicações. Laboratório de Análises Toxicológicas – LAT Auxílio ao diagnóstico de intoxicações.

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ANÁLISES TOXICOLÓGICAS

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Presentation Transcript

  1. INTRODUÇÃO AO PLANEJAMENTO DE ANÁLISES NOÇÕES PARA A PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS ANÁLISES TOXICOLÓGICAS Paula Christiane Soubhia Laboratório de Toxicologia Centro de Controle de Intoxicações

  2. Laboratório de Análises Toxicológicas – LATAuxílio ao diagnóstico de intoxicações Análises quali/quanti Administração de antídotos Diagnóstico diferencial Prognóstico – nomogramas Biomonitorização Pesquisas: toxinologia, toxicocinética, analíticas

  3. Informações História Indivíduo: anamnese Síndrome tóxica Agente tóxico suspeito Quantidade Circunstância Horário da intoxicação PESQUISA DO AGENTE TÓXICO

  4. AMOSTRA • MÉTODO Planejamento da análise 1) Direcionamento – o que pesquisar e onde? 2) Tipos de matrizes biológicas 3) Preparação da amostra - Liberação dos analitos da matriz - Remoção de interferentes endógenos - Técnicas de extração - Aumento da seletividade e sensibilidade 4) Técnicas CCD Cromatografia em fase gasosa Cromatografia líquida

  5. Tipos de Amostras

  6. Sangue Sangue total, soro e/ou plasma • Matriz complexa • Anticoagulante • Hemólise • Volume: menor disponibilidade • Correlação com o efeito • Período de detecção: • Etanolemia: assepsia com degermante sem álcool.

  7. Urina Triagens qualitativas Disponível em grandes volumes Coleta não invasiva > Chance de encontrar a substância Presença de produtos de biotransformação Dulteração Triagem Só indicativo de uso Quantificação correção com creatinina

  8. Conteúdo gástrico • Análises qualitativas • Coletar a 1ª porção • Grande volume disponível • Agente tóxico em grandes concentrações e não biotransformado

  9. Amostra ESTABILIDADE Matriz Tipo de agentetóxico: medicamentos, metais, praguicidas ARMAZENAMENTO Período Tubosespeciais: metais (HNO3 10%, águadeionizada) - complexação Praguicidas (acetona) - resíduos

  10. ANÁLISES TOXICOLÓGICAS Diagnóstico clínico Forense Doping Controle terapêutico Biomonitorização APLICAÇÃO ÁREAS O QUE SE ESPERA ENCONTRAR PROD INALTERADO/BIOTRANSFORMADO QUALI QUANTI sensibilidade TRIAGEM

  11. TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS EM ANÁLISES TOXICOLÓGICAS A preparação de amostras pode ser considerada como uma série de operações unitárias necessárias para que determinada substância (analito) possa ser detectada pela técnica analítica de escolha.

  12. ANÁLISES TOXICOLÓGICAS Técnicas analíticas Cromatográficas Espectrométricas Imunoensaios Espectrotométricas Colorimétricas

  13. EQUIPAMENTOS DE CROMATOGRAFIA

  14. Típicas operações em preparação de amostras: A) Liberação dos analitos da amostra B) Remoção de interferentes endógenos C) Técnicas de extração D) Aumento da seletividade e sensibilidade

  15. A) Liberação dos analitos da amostra Analito na matriz - conjugado - livre

  16. Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOH Delta-9-Tetraidrocanabinol (THC) Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado BIOTRANSFORMAÇÃOMaconha - 9THC

  17. SUBSTÂNCIAS CONJUGADAS Hidrólise - Alcalina - Ácida - Enzimática

  18. O O á c i d o g l i c u r ô n i c o C O C O H O H O H C H 3 C H 3 O C H 5 11 C H O C H 3 5 11 C H 3 HIDRÓLISE ALCALINA • Vantagens: • -processo mais rápido • -custo baixo • - Desvantagens: • -degradação de analitos não estáveis • p.ex. benzodiazepínicos 60°C NaOH Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOH

  19. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA Esteróides Anabólicos conjugados Beta glucuronidase Esteróides Anabólicos livres 55°C/1 hora • Vantagens: • -não degrada os analitos • - Desvantagens: • -custo mais alto • -maior tempo de reação • -controle mais rigoroso das condições • -enzimas podem ser inibidas por substâncias presentes nas amostras

  20. B) Remoção de interferentes endógenos Uma matriz biológica consiste de muitos componentes, como proteínas, lipídios, carboidratos que podem interferir na análise.

  21. B) Remoção de interferentes endógenos - PROTEÍNAS - Matriz: sangue total/plasma Determinação: fármacos (ligado/livre) Método: precipitação/desnaturação Finalidades: precipitação em contato com a fase móvel e obstruir a coluna cromatográfica

  22. Agentesprecipitantes- alteração da solubilidade na solução aquosa Ácidos: formação de sais insolúveis com a forma catiônica das proteínas • Ácido tricloroacético e ácido perclórico Solventes orgânicos: solventes que são miscíveis em água como acetona, metanol, etanol e acetonitrilapodem abaixar a solubilidade de proteínas. Sais: retirada da água de solvatação e diminuição da solubilidade das proteínas – efeito salting-out : sulfato de amônio

  23. C) Técnicas de extração 1) Extração líquido-líquido (LLE) 2) Extração em fase sólida (SPE) 3) Extração por head space (HS) 4) Micro extração em fase sólida (SPME) 5) Derivação

  24. C) Técnicas de extração Transferir os analitos (matriz original) de forma adequada para análise em instrumentação cromatográfica

  25. Extração Propriedades físico-químicas (analitos, interferentes e matriz) Polaridade Solubilidade Estabilidade química e térmica Clean-up – interferentes endógenos ou exógenos Concentração – sensibilidade Tempo: 80% da análise

  26. 1) Extração líquido-líquido (LLE) Extração direta do material biológico com um solvente imiscível com a água. Fenômeno: partição Coeficiente de partição/distribuição: K= C2/C1 pH fase aquosa proporção vol. das fases ↑ da fase extratora 2 ou mais extrações

  27. Solventeorgânico urina Drogas/ metabólitos urina Agitação Centrifugação Separação da fase orgânica Extrato ELL

  28. Solvente extrator • Solubilidade da substância (ordem de polaridade – série eluotrópica) • Baixa viscosidade – interação com a matriz • Baixo ponto de ebulição • Corrosão em equipamentos • Toxicidade • Menos polares: matrizes biológicas • Custo • Aditivos e estabilizadores de solventes

  29. ESCOLHA DOS SOLVENTES Drogas ácidas e neutras • acetato de etila, diclorometano, éter-isopropanol 7:3, n-hexano-éter 1:1, entre outros. Drogas básicas e neutras • álcool isoamílico 1 ou 2% em n-hexano, éter etílico, diclorometano, n-hexano-acetato de etila 7:3, etc Praguicidas • n-hexano, éter de petróleo Metais • metil-isobutilcetona (Pb-pirrolidina ditiocarbamato de amônia)

  30. OH -- Forma ionizada H C H C H N 2 H H C H 3 C H C H N 2 H Matriz Anfetamina C H 3 neutro INFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADE Substâncias de caráter básico – extração básica Ex. anfetaminas Ajuste do pH NaOH 2% Impurezas ácidas Convertidos em ânions

  31. O C O H Neutro O H O C H 3 O C H C O H 5 11 C H 3 O H C H 3 O C H 5 11 C H 3 INFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADE Substâncias de caráterácido – Extraçãoácida Ex. ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH Ajuste do pH HCl 5% Impurezas básicas cátions H+ ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH

  32. AJUSTE DE pH Drogas ácidas e neutras • Soluções ácidas (HCl diluido, NH4Cl saturado, tampão acetato, tampão fosfato) • Tampões sólidos (fosfato) Drogas básicas e neutras • Soluções alcalinas (NaOH diluído, NH4OH diluido, Na2CO3, Na3BO3, tampão fosfato, tampão borato) • Tampões sólidos (carbonato/bicarbonato)

  33. H H C C H H C C H H N N 2 2 H H C C H H 3 3 Na+ Cl- ELL • Melhora do coeficiente de partição/distribuição entre um solv. orgânico e a aquosa • Diminui a formação de emulsões • Aumenta a recuperação do analito Efeito Salting-out = molécula de água + NaCl +

  34. Vantagens - ELL • Fácil execução • Não requer instrumentação especial • Boa seletividade • Grande variedade de sistemas de extração

  35. Desvantagens - ELL • Amostras com alta afinidade com a fase aquosa • Impurezas do solvente • Formação de emulsões • Toxicidade do solvente extrator • Grandes volumes de amostra e solvente – resíduos • Procedimento trabalhoso e demorado • Difícil automação

  36. 2) EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA Extração em Fase Sólida (SPE) A técnica de SPE é a mais utilizadas no preparo de amostras, tanto quando se quer pré-concentrar compostos de interesse, quanto em casos em que se pretende simplesmente separá-los de constituintes que possam interferir na análise.

  37. Fluído biológico é misturado com um adsorvente e posteriormente eluido com solvente apropriado. • Mecanismo de retenção das substâncias • Adsorção • Partição • Mecanismos de dessorção • Solvente orgânico • Dessorção térmica

  38. EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA ETAPAS • Condicionamento:Umidificação e ativação dos • Adição da amostra: Retenção quantitativa do composto de interesse e remoção de parte da matriz • Lavagem: Remoção da maioria dos componentes da matriz, o que aumenta a seletividade • Eluição: Eluição quantitativa do composto de interesse na coluna

  39. EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA Amostra + água + PI + tampão fosfato Diclorometano/ isopropanol / NH3 (80:20:2) Metanol + tampão fosfato Água + HCl 0,1M + metanol BE PI Interf. COC 1 2 3 4

  40. EFS aparato PREENCHIMENTO Fase sólida - • empacotada em coluna (cartuchos) Natureza • Polímeros porosos

  41. CH Ciclo hexil Tipos de colunas (SPE) APOLARES/fase reversa: octadecil, octil, fenil INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals) C8 Octil S i PH Fenil S i

  42. Tipos de colunas (SPE) POLARES/fase normal: cianopropil, diol INTERAÇÕES tipo hidrofílica: dipolo-dipolo, pontes H N S i C CN Cianopropil O H NH2 Aminopropil H S i N H O H 2OH Diol S i O O H O H H N H

  43. Tipos de colunas (SPE) - TROCA IÔNICA - INTERAÇÕES IÔNICAS (Eletrostáticas) O CBA Ácido carboxílico C - S i O + N H R 3 SCX Ácido benzenosulfônico S i - + S O N H 3 3 SAX Trimetil aminopropil + - S i N ( C H ) S O R 3 3 3

  44. FATORES QUE AFETAM A EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA • pH • Tipo de amostra • Volume de amostra • Tratamento do adsorvente • Condicionamento • Lavagem • Dessorção (eluição)

  45. EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAVANTAGENS / DESVANTAGENS • Redução do volume da amostra e do solvente extrator • Maior rapidez na análise • Aumento de eficiência da extração (recuperação) • Não formação de emulsões • Volume de evaporação diminuído • Maior facilidade de automação • Maior seletividade • Boa reprodutibilidade • Várias possibilidades de adsorventes e solventes • Alto custo, importação • Viscosidade da amostra afeta o fluxo

  46. 3) EXTRAÇÃO POR HEAD SPACE DETERMINAÇÃO DE VOLÁTEIS Amostra (urina, sangue ou saliva) + sulfato de sódio + PI seringa ESTUFA 70°C 30 min GC

  47. 4) MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) -Baseado na partição do analito entre a fibra de extração e a matriz (amostra)

  48. 1 2 3 4 5 6 SPME

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