Long PCR

1. Katarzyna Nikityn Daniel Pędziwiatr Grzegorz Polikiewicz Biotechnologia, Rok III, Gr. IIA 30.10.2006 r. Long PCR

2. Istota metody • Long PCR (Long range PCR) to metoda pozwalająca amplifikować dłuższe fragmenty DNA. • Standardowa reakcja PCR umożliwia amplifikację fragmentów o długości maksymalnej ok. 5 kb, ze względu na dużą możliwość błędów popełnianych przez polimerazę przy amplifikacji tak długich fragmentów • W metodzie Long PCR oprócz standardowej polimerazy o aktywności 5’ – 3’ dodaje się do mieszaniny reakcyjnej mniejsze stężenie polimerazy o aktywności egzonukleazy 3’5’, która „poprawia” błędy popełnione przez polimeraze 5’-3’ przy amplifikacji dłuższych fragmentów • Jako standardowej polimerazy używa się polimerazy Taq lub Klentaq1 • Jako polimerazy o aktywności nukleazy najczęściej używa się polimerazy Pwo lub Pfu

3. Możliwości long PCR • Long PCR umożliwia amplifikację fragmentów o długości od 5 do ponad 40 kb (najczęściej jest to 10 -20 kb). • Charakteryzuje się 3-krotnie lepszą dokładnością niż standardowa metoda PCR

4. Podstawową metodą wykrywania dużych delecji jest Southern blotting. Jednak ta technika jest złożona, czasochłonna i stąd kosztowna. Dlatego w celu wykrywania mutacji w dużych genach stosuje się technikę long PCR. Jej zastosowanie umożliwia np. wykrycie dużych delecji w genomie (np. u pacjentów z zespołem Hippel-Lindau.