ENZIMAS

1. ENZIMAS Praticamente todas as reações no corpo são mediadas por enzimas, as quais são proteínas catalisadoras que aumentam a velocidade das reações, sem sofrerem alterações no processo global. Dentre as muitas reações biológicas que são energicamente possíveis, as enzimas seletivamente canalizam reatantes (chamados substratos) para rotas úteis. As enzimas direcionam, assim, todos os eventos metabólicos. I. NOMENCLATURA Casa enzima recebe dois nomes. O primeiro é um nome curto, o nome recomendado, conveniente para uso corriqueiro. O segundo é mais completo, o nome sistemático, o qual é utilizado quando uma enzima precisa ser identificada sem ambigüidades. Os nomes de enzimas mais comumente usados têm o sufixo “-ase” adicionado ao nome do substrato da reação (por exemplo, glicosidase, urease, sacarase) ou à descrição da ação realizada (por exemplo, lactato-desidrogenase e adenilato-ciclase). (algumas enzimas mantêm seu nome trivial original, o qual não tem qualquer associação com a reação enzimática, por exemplo, tripsina e pepsina)

2. II. PROPRIEDADES DAS ENZIMAS • As enzimas são catalisadores protéicos que aumentam a velocidade de uma reação química e não são consumidos durante a reação que catalisam. (Alguns tipos de RNA podem atuar como enzimas, geralmente catalisando a quebra e a síntese de ligações fosfo-diéster. Os RNAs com atividade catalítica são chamados ribozimas e são encontrados com muito menos freqüência que as proteínas catalisadoras).

3. Sítios ativos • As moléculas de enzimas contêm uma região específica formando uma fenda que é chamada sítio ativo. O sítio ativo contém cadeias laterais de aminoácidos, as quais criam uma superfície tridimensional complementar ao substrato. O sítio ativo liga o substrato, formando um complexo enzima-substrato (ES). O complexo ES é convertido em enzima-produto (EP), o qual subseqüentemente se dissocia em enzima e produto.

4. B. Eficiência catalítica • A reações catalisadas por enzimas são, em sua maioria, altamente eficientes, ocorrendo de 103 a 108 vezes mais rapidamente do que as reações não catalisadas. C. Especificidade • As enzimas são altamente específicas, interagindo com um ou alguns poucos substratos e catalisando apenas um tipo de reação química. D. Co-fatores • Algumas enzimas se associam com um co-fator não-protéico, o qual é necessário para a atividade enzimática. Os co-fatores comumente encontrados incluem íons metálicos, tais como Zn2+ ou Fe2+, e moléculas orgânicas, conhecidas como coenzimas, que freqüentemente são derivadas de vitaminas. Por exemplo, a coenzima NAD+ contém niacina, o FAD contém riboflavina e a coenzima A contém ácido pantotênico. O conjunto da enzima com o seu co-fator é chamado holoenzima. A apoenzima refere-se à porção protéica da holoenzima. Na ausência do co-fator apropriado, a apoenzima geralmente não apresenta atividade biológica. Um grupo prostético é uma coenzima firmemente ligada à enzima, que desta não se dissocia (por exemplo, a biotina ligada a carboxilases).

5. E. Regulação • A atividade enzimática pode ser regulada, isto é, as enzimas podem ser ativadas ou inibidas, de modo que a velocidade de formação do produto responda às necessidades da célula. F. Localização dentro da célula • Muitas enzimas estão localizadas em organelas específicas dentro da célula (Figura ao lado). Esta compartimentalização serve para isolar o substrato ou o produto da reação de outras reações competitivas. Isso garante o meio favorável para a reação e organiza as milhares de enzimas presentes na célula em vias definidas.

6. III. COMO FUNCIONAM AS ENZIMAS • O mecanismo da ação enzimática pode ser encarado de duas perspectivas diferentes. A primeira aborda a catálise em termos de alterações de energia que ocorrem durante a reação, ou seja, as enzimas fornecem uma rota de reação alternativa, energicamente favorável, diferente da reação não-catalisada. A segunda perspectiva descreve como o sítio ativo facilita quimicamente a catálise. A. Alterações de energia que ocorrem durante a reação • Praticamente todas as reações têm uma barreira de energia separando os reatantes dos produtos. Essa barreira, denominada energia livre de ativação, é a diferença entre a energia dos reatantes e aquela de um intermediário de alta energia, que ocorre durante a formação do produto.

7. 1. Energia livre de ativação. O pico de energia é a diferença na energia livre entre os reatantes e T*, onde um intermediário rico em energia é formado durante a conversão do reatante em produto. Devido à grande energia de ativação, as velocidades das reações químicas não-catalisadas são freqüentemente lentas. • 2. Velocidade da reação. Para as moléculas reagirem, devem conter energia suficiente para superar a barreira de energia do estado de transição. Na ausência de uma enzima, somente uma pequena proporção da população de moléculas pode possuir energia suficiente para atingir o estado de transição entre reatante e produto. A velocidade da reação é determinada pelo número dessas moléculas “energizadas”. Em geral, quanto menor a energia livre de ativação, mais moléculas têm energia suficiente para superar o estado de transição e, assim, mais rápida é a velocidade da reação. • 3. Rota alternativa de reação. Uma enzima permite que uma reação ocorra rapidamente nas condições normais na célula, oferecendo uma rota de reação alternativa, com uma menor energia livre de ativação. A enzima não altera a energia livre dos reatantes ou dos produtos e, assim sendo, não altera o equilíbrio da reação.

8. IV. FATORES QUE AFETAM A VELOCIDADE DA REAÇÃO • As diferentes enzimas mostram diferentes respostas às alterações de concentração de substrato, temperatura e pH. A. Concentração do substrato • 1. Velocidade máxima. A velocidade de uma reação (v) é o número de moléculas de substrato convertidas em produto por unidade de tempo. A velocidade de uma reação catalisada por enzima aumenta conforme a concentração do substrato, até uma velocidade máxima (Vmax) ser atingida. A obtenção de um platô na velocidade de reação em altas concentrações de substrato reflete a saturação pelo substrato de todos os sítios de ligação disponíveis nas moléculas enzimáticas presentes.

9. B. Temperatura • 1. Aumento da velocidade com a temperatura. A velocidade de reação aumenta com a temperatura, até um pico de velocidade ser atingido. Esse aumento é devido ao aumento do número de moléculas com energia suficiente para atravessar a barreira de energia e formar os produtos da reação. • 2. Diminuição da velocidade com a temperatura. Uma elevação maior da temperatura resulta em redução na velocidade de reação, como resultado da desnaturação da enzima, induzida pela temperatura (figura ao lado).

10. C. pH • 1. Efeito do pH sobre a ionização do sítio ativo. A concentração de H+ afeta a velocidade de reação de várias maneiras. Primeiro, o processo catalítico geralmente requer que a enzima e o substrato tenham determinados grupos químicos em um estado ionizado ou não-ionizado, de modo a interagirem. Por exemplo, a atividade catalítica pode requerer que um grupo amino da enzima esteja na forma protonada (-NH3+). Em pH alcalino, esse grupo não está protonado e, desse modo, a velocidade da reação diminui. • 2. Efeito do pH sobre a desnaturação da enzima. Valores extremos de pH também podem levar à desnaturação da enzima, pois a estrutura da molécula protéica cataliticamente ativa depende do caráter iônico das cadeias laterais dos aminoácidos. • 3. O pH ótimo varia de acordo com a enzima. O pH no qual a atividade máxima da enzima é atingida difere para cada enzima e, geralmente, reflete a [H+] na qual a enzima funciona no organismo. Por exemplo, a pepsina, uma enzima digestiva do estômago, apresenta atividade máxima em pH2, enquanto outras enzimas, destinadas a funcionar em pH neutro, são desnaturadas em meio com essa acidez .

12. V. EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN A. Modelo de reação Michaelis e Menten propuseram um modelo simples, que explica a maioria das características das reações catalisadas por enzimas. Nesse modelo, a enzima combina-se reversivelmente com o substrato, formando um complexo ES que, subseqüentemente, degrada-se em produto, regenerando a enzima livre. O modelo, envolvendo uma molécula de substrato, é representado a seguir: K1 K2 E + S ↔ ES → E + P K-1 onde S é o substrato E é a enzima ES é o complexo enzima-substrato K1, K - 1 e K2 são as constantes de velocidade

13. B. Equação de Michaelis- Menten A equação de Michaelis-Menten descreve como a velocidade da reação varia com a concentração do substrato: VO = VMAX [S] Km + [S] Onde VO = velocidade inicial de reação VMAX = velocidade máxima KM = constante de Michaelis = (K- 1 + K2 )/ K 1 [S] = concentração de substrato

14. Ao derivar-se a equação de velocidade de Michaelis-Menten, são feitas as considerações a seguir. 1. Concentrações relativas de E e S. A concentração de substrato ([S]) é muito maior do que a concentração da enzima ([E]), de modo que a porcentagem de substrato ligado à enzima em qualquer tempo é pequena. 2. Hipótese do estado de equilíbrio. A [ES] não varia com o tempo hipótese do estado de equilíbrio), isto é, a velocidade de formação de ES é igual àquela da degradação de ES (para E + S e para E + P). Em geral, um intermediário em uma série de reações é dito estar em estado de equilíbrio quando sua velocidade de síntese é igual a sua velocidade de degradação. 3. Velocidade inicial. Somente as velocidades iniciais da reação (VO) são utilizadas na análise das reações enzimáticas. Isso significa que a velocidade de reação é medida assim que a enzima e o substrato são misturados. Nesse momento, a concentração de produto é muito pequena e, assim sendo, a velocidade de reação inversa de P para S pode ser ignorada.

15. C. Conclusões importantes sobre a cinética de Michaelis-Menten 1. Características do KM. KM - a constante de Michaelis – é característico de uma enzima e de determinado substrato seu, e reflete a afinidade da enzima para aquele substrato. O KM é numericamente igual à concentração do substrato na qual a velocidade da reação é igual a ½ VMAX.. O KM não varia com a concentração da enzima. a. Km baixo. Um Km numericamente pequeno reflete uma alta afinidade da enzima pelo substrato, pois uma baixa concentração de substrato é necessária para atingir a metade da saturação da enzima – isto é, atingir a velocidade que é ½ Vmax (figura ao lado). b. Km alto. Um Km numericamente grande (elevado) reflete uma baixa afinidade da enzima pelo substrato, pois é necessária uma alta concentração de substrato para atingir a metade da saturação da enzima.

17. 2. Relação entre a velocidade e a concentração da enzima. A velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração da enzima em qualquer concentração de substrato. Por exemplo, se a concentração da enzima é reduzida pela metade, a velocidade inicial da reação (VO), assim como Vmax, são reduzidas à metade da velocidade original. 3. Ordem de reação. Quando a [S] é muito menor que o Km, a velocidade da reação é aproximadamente proporcional à concentração do substrato A velocidade da reação é então dita de primeira ordem com relação ao substrato. Quando a [S] é muito maior do que o Km, a velocidade é constante e igual à VMAX. A velocidade da reação, nesse caso, é independente da concentração de substrato e é dita de ordem zero em relação à concentração de substrato

19. VI. INIBIÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA Qualquer substância que possa diminuir a velocidade de uma reação catalisada por uma enzima é chamada de inibidor. Inibidores reversíveis ligam-se à enzima por meio de ligações não-covalentes. A diluição do complexo enzima-inibidor resulta na dissociação do inibidor reversivelmente ligado e na recuperação da atividade enzimática. A inibição irreversível ocorre quando uma enzima inibida não recupera sua atividade quando o complexo enzima-inibidor é diluído. Os dois tipos mais comuns de inibição encontrados são inibição competitiva e inibição não-competitiva. A. Inibição competitiva Esse tipo de inibição ocorre quando o inibidor liga-se reversivelmente ao mesmo sítio que o substrato normalmente ocuparia e, dessa forma, compete com o substrato por esse sítio.

20. 1. Efeito sobre a VMAX. O efeito de um inibidor competitivo é revertido pelo aumento da [S]. Em uma concentração de substrato suficientemente alta, a velocidade da reação atinge a VMAX observada na ausência do inibidor.

21. 2. Efeito sobre o KM. Um inibidor competitivo aumenta o Km aparente para determinado substrato. Isso significa que, na presença de um inibidor competitivo, mais substrato é necessário para atingir ½ VMAX. 3. Estatinas como exemplos de inibidores competitivos. Esse grupo de drogas anti-hiperlipidêmicas inibe competitivamente o primeiro passo comprometido com a síntese do colesterol. A reação é catalisada pela hidroximetilglutaril-CoA-redutase (HMG-CoAredutase). As estatinas, tais como a atorvastatina (Liptor) e a sinvastatina, são análogos estruturais do substrato natural dessa enzima e competem efetivamente, inibindo a HMG-CoA-redutase. Dessa forma, elas inibem a síntese de novo do colesterol e, assim, diminuem os níveis plasmáticos de colesterol.

22. B. Inibição não-competitiva Esse tipo de inibição pode ser reconhecido por seu efeito característico sobre VMAX. A inibição não-competitiva acontece quando o inibidor e o substrato ligam-se a sítios diferentes sobre a enzima. O inibidor não-competitivo pode ligar-se tanto à enzima livre quanto ao complexo ES, de modo a impedir que a reação ocorra. 1. Efeito sobre a VMAX. A inibição não competitiva não pode ser superada pelo aumento da concentração de substrato. Desse modo, os inibidores não-competitivos diminuem a VMAX da reação. 2. Efeito sobre o Km. Os inibidores não-competitivos não interferem na ligação do substrato com a enzima. Assim sendo, a enzima mostra o mesmo KM na presença e na ausência do inibidor não-competitivo. 3. Exemplos de inibidores não-competitivos. Alguns inibidores agem pela formação de ligações covalentes com grupos específicos da enzima. Por exemplo, o chumbo forma ligações covalentes com os grupos sulfidrila da cadeia lateral da cisteína nas proteínas. A ligação do metal pesado mostra uma inibição não-competitiva. A ferroquelatase, uma enzima que catalisa a inserção do Fe2+ na protoporfirina, é um exemplo de enzima sensível à inibição pelo chumbo. Outros exemplos de inibidores não-competitivos são certos inseticidas, cujos efeitos neurotóxicos são resultantes de sua ligação irreversível ao sítio catalítico da enzima acetilcolinesterase (uma enzima que cliva o neurotransmissor acetilcolina).

23. C. Inibidores enzimáticos como drogas Pelo menos metade das dez drogas mais comumente prescritas Nos Estados Unidos age por meio da inibição de enzimas. Por exemplo, os amplamente prescritos antibióticos β-lactâmicos, como a penicilina e amoxicilina atuam inibindo uma ou mais enzimas envolvidas na síntese da parede celular bacteriana. As drogas também podem agir inibindo reações extracelulares. Isso é ilustrado pelos inibidores da Enzima conversora de angiotensina (ECA). Eles diminuem a pressão sangüínea por bloquear a enzima, que cliva a angiotensina I para formar a forma vasoconstritora, a angiotensina II. Estas drogas, que incluem o captopril, o enalapril e o linosopril, causam a vasodilatação e, com isso, uma redução da pressão arterial.

24. VII. REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA A regulação da velocidade das reações enzimáticas é essencial para o organismo coordenar seus numerosos processos metabólicos. As velocidades da maioria das enzimas respondem a mudanças na concentração dos substratos, pois, o nível intracelular de muitos dos substratos se encontra na faixa do KM. Dessa forma, um aumento na concentração do substrato é refletido no aumento da velocidade de reação, o que tende a fazer a concentração do substrato retornar ao valor normal. Além disso, algumas enzimas com funções reguladoras especializadas respondem a efetores alostéricos ou a modificações covalentes, ou ainda, possuem a velocidade de sua síntese alterada quando as condições fisiológicas são alteradas. A. Sítios alostéricos de ligação As enzimas alostéricas são reguladas por moléculas chamadas efetores (também chamados de modificadores ou moduladores), os quais ligam-se de forma não-covalente a outro sítio que não o sítio catalítico. A presença de um efetor alostérico pode alterar a afinidade da enzima pelo seu substrato ou modificar a atividade catalítica máxima da enzima ou ambos. Os efetores que inibem a atividade enzimática são denominados efetores negativos, enquanto aqueles que aumentam a atividade enzimática são denominados efetores positivos.

25. 1. Efetores homotrópicos. Quando o substrato em si atua como efetor, o efeito é dito homotrópico. 2. Efetores heterotrópicos. O efetor pode ser diferente do substrato, em cujo caso o efeito é dito heterotrópico. (Por exemplo, considere a inibição por retroalimentação mostrada na figura abaixo). A enzima que converte A em B tem sítio alostérico, no qual se liga o produto final E. Se a concentração de E aumenta, a enzima inicial da rota é inibida. A inibição por retroalimentação fornece à célula um produto de que ela necessita regulando o fluxo de moléculas de substrato em uma via que leva à síntese daquele produto.

26. B. Regulação de enzimas por modificação covalente Muitas enzimas podem ser reguladas pela adição ou pela remoção de grupos fosfato de resíduos específicos. A fosforilação de proteínas é reconhecida como uma das principais formas pelas quais os processos celulares são regulados. 1. Fosforilação e desfosforilação. As reações de fosforilação e desfosforilação são catalisadas por uma família de enzimas, denominadas de proteína-cinases, as quais utilizam trifosfato de adenosina (ATP) como doador de fosfato. Os grupos fosfato são clivados de enzimas fosforiladas pela ação das fosfoproteínas-fosfatases. 2. Resposta da enzima à fosforilação. Dependendo da enzima específica, a forma fosforilada pode ser mais ou menos ativa do que a forma não-fosforilada. Por exemplo, a fosforilação da glicogênio-fosforilase (enzima que degrada o glicogênio) aumenta sua atividade, enquanto a adição de fosfato à enzima glicogênio-sintase (enzima que sintetiza o glicogênio) diminui sua atividade.

27. C. Indução a repressão da síntese de enzimas Os mecanismos reguladores descritos previamente modificam a atividade de moléculas enzimáticas existentes. Entretanto, as células também podem regular a quantidade de enzima presente – em geral alterando a velocidade da síntese da enzima. O aumento (indução) ou a diminuição (repressão) da síntese da enzima leva a uma alteração nas população total de sítios ativos. (Nesse caso, a eficiência das moléculas existentes da enzima não é afetada). Por exemplo, níveis elevados de insulina, como resultado de altos níveis de glicose no sangue, levam a um aumento na síntese de enzima-chave no metabolismo da glicose. Em contraste, enzimas que são continuamente utilizadas geralmente não são reguladas pela alteração da velocidade de sua síntese. Alterações dos níveis enzimáticos como resultado da indução ou da repressão da síntese protéica são lentas (de horas a dias), comparadas com as alterações reguladas alostericamente, as quais ocorrem em segundos a minutos.

28. VIII. ENZIMAS NO DIAGNÓSTICO CLÍNICO As enzimas plasmáticas podem ser classificadas em dois grupos principais. Primeiro, um grupo relativamente pequeno de enzimas, que é seletivamente secretado no plasma por certos tipos celulares. Por exemplo, o fígado secreta os zimogênios (precursores inativos) de enzimas envolvidas na coagulação sangüínea. Segundo, um grande número de enzimas é liberado das células durante a renovação celular normal. Essas enzimas quase sempre atuam intracelularmente e não têm função fisiológica no plasma. Em indivíduos saudáveis o nível dessas enzimas é razoavelmente constante e representa um estado de equilíbrio, no qual a velocidade de liberação dessas enzimas no plasma pelas células danificadas é equilibrada por uma velocidade igual de remoção do plasma. A presença de atividade enzimática elevada no plasma pode indicar lesão tecidual, que é acompanhada pela liberação aumentada de enzimas intracelulares (Plasma é o fluido, a parte não-celular do sangue. Exames de laboratório para atividades enzimáticas mais freqüentemente utilizam o soro, o qual é obtido pela centrifugação do sangue total após ele ter coagulado. O plasma é um líquido fisiológico, enquanto o soro é preparado no laboratório.)

30. A. Alterações dos níveis plasmáticos de enzimas em doença Muitas doenças que causam lesão tecidual resultam no aumento da liberação das enzimas intracelulares no plasma. As atividades de muitas dessas enzimas são rotineiramente determinadas para fins de diagnóstico em doenças do coração, do fígado, do músculo esquelético e de outros tecidos. O nível de atividade enzimática específica no plasma freqüentemente está relacionado com a extensão da lesão tecidual. Assim, a determinação do grau de aumento da atividade de uma determinada enzima no plasma em geral é útil para a avaliação do prognóstico do paciente. Por exemplo, a enzima alanina-aminotransferase (ALT) é abundante no fígado. O aparecimento de níveis elevados de ALT no plasma sinaliza uma possível lesão do tecido hepático. Os níveis plasmáticos de creatina-cinase (CK) e de lactato-desidrogenase (LDH) são comumente determinados para o diagnóstico do infarto do miocárdio. Eles são particularmente úteis quando o eletrocardiograma é de difícil interpretação, como quando tenha havido episódios prévios de doença cardíaca.