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Régulation génétique par les petits ARN non-codants

Institut Pasteur « Génétique de la souris » 27 janvier (1h30). Régulation génétique par les petits ARN non-codants. Christophe ANTONIEWSKI antoniew@pasteur.fr. Découverte de l’interférence par l’ARN. Interférence par l’ARN. Injection. transfection. feeding. Viruses. ARN double-brin

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Régulation génétique par les petits ARN non-codants

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Presentation Transcript

  1. Institut Pasteur « Génétique de la souris » 27 janvier (1h30) Régulation génétique par les petits ARN non-codants Christophe ANTONIEWSKI antoniew@pasteur.fr

  2. Découverte de l’interférence par l’ARN

  3. Interférence par l’ARN Injection transfection feeding Viruses ARN double-brin Post Trancriptional Gene Silencing (dégradation de l’ARNm de séquence homologue) Homology dependent Cosuppression Inverted-repeat transcription Exogenous Endogenous

  4. 1ère partie: siRNA (small interfering RNA) Luc dsRNA* Cyc dsRNA* S2 Extract Dicer Immunoprecipitation Bernstein et al. Nature(2001) 409: 363 Elbashir et al. Genes & Development(2001) 15: 188-200

  5. Caractéristiques des siRNA (O-Met-2’) (2’-O-Met) • 19 nucléotides double-brin • 2 nucléotides débordants en 3’(OH) • Activité RNAi per se • Activité séquence-spécifique • Ciblent ARN sens et antisens • 2’-O-Met (in vivo)

  6. Williams RW, Rubin GM PNAS 2002 Le complexe RISC (RNA Induced Silencing Complex) Argonautes Deux groupes de protéines selon la présence d’aa conservés N-term: AGO-1, AGO-2 : ubiquitaires Piwi, Aubergine, AGO-3: Lignée Germinale

  7. RNA Induced Silencing ComplexRISC mRNA degradation Helicase ? (Armitage/sde3) DG DG R2D2 se fixe à l'extrémité la + stable Recrutant Dcr à l'extrémité la - stable R2D2 "reconnaît" le 5'P du brin "passager" Cleavage and release of the "passenger" strand

  8. 2ème partie: les microRNA Lin-14, lin28 Lin-41, hbl1 lin-4 lin14 CDS 3’ UTR

  9. Ordres de grandeur Genome miRNA identifiés expérimentalement ~150 ~150 ~700 ~700 C. elegans D. melanogaster M. musculus H. sapiens

  10. Structure des gènes des miRNAs - primary miRNA (pri-miRNA) • Pri-miRNA : • « Cappés » • Queue Poly-A • Pol II-dépendants miRNA autonomes ~50% ~50% miRNA "passagers" Rare

  11. Pri-miRNA --> Pré-miRNA Seitz and Zamore Cell 125, p827, June 2, 2006 Han et al. Cell 125, 887–901, June 2, 2006

  12. Pri-miRNA --> Pré-miRNA : le complexe « microprocessor » Seitz and Zamore Cell 125, p827, June 2, 2006 Han et al. Cell 125, 887–901, June 2, 2006

  13. Biogenèse des miRNA 1 G Biais 5’U RISC Mais quelle Argonaute ?

  14. « specialized » miRNA and siRNA pathways in Drosophila

  15. Répression traductionnelle Vs clivage Saxena et al JBC 2003

  16. La séquence « graine » (seed) Doench et al G&D 2004 Stark et al Plos Biol 2004  Dur de trouver une cible de miRNA !

  17. Les miRNA agissent aussi en déstabilisant les mRNA cibles Lim et al. (2005) NATURE VOL 433, p770 miR124 fortement exprimé dans le cerveau  Transfection de miR 124 dans des cellules Hela  174 gènes réprimés (Niveau ARN)

  18. Modèles d’action des miRNA Eulalio et al, Cell 2008

  19. Fonction des miRNAs au cours du développement Adapted from Alvarez-Garcia and Miska, Development 2005

  20. They target Bcl2, upregulated in many types of cancers cMyc target + regulates E2F1 Trangenic mice overexpression miR17 harbor c-myc-induced lymphomas Amplified in B Cell lymphoma miR17 miRNA et Cancers Classification of human cancers using miRNA profiling Lu et al (2005). Nature 435, 834

  21. 3ème partie: les piRNA Bergman et al. Genome Biology 2006, 7:R112 • 25 paires de bases • Biaisés en 5’: U (80% des cas) • 2’-O-méthylés à l'extrémité 3’ • Correspondent majoritairement à des éléments transposables (transposons et rétrotransposons)  rasiRNA • surtout abondants dans la lignée germinale (ovaires et testicules) Aravin et al. Developmental Cell (2003), Vol. 5, 337–350.

  22. piRNAs Co-immunoprécipitation par anti-Piwi À partir d’extraits d’ovaires Clonage/séquençage des petits RNA associés Les piRNAs représentent 80% des petits ARN coprécipités avec un Anti-Piwi Il correspondent bien à des éléments répétés du génome (rasiRNA). Saito et al., Genes and Dev (2006)

  23. Les piRNA sont majoritairement « antisens » Saito et al., Genes and Dev (2006)

  24. Dans la lignée germinale, les piRNA répriment l’expression des Elements Transposables Vagin et al., Science (2006) La voie classique RNA-i est sans effet sur le contrôle des rétroéléments Pas de contrôle par dcr1 sur mdg1, roo et mst40: la voie miRNA est également sans effet Les acteurs importants pour le silencing des rétroéléments sont Piwi, Aubergine, armi, et Spn-E (Homeless)

  25. Séquençage direct de molécules uniques Pyroséquençage « 4-5-4 » From Margulies, M., et al. (2005). Nature 437, 376-380. Solexa, Solid, Helico… 10 à 100 millions de lectures, de ~ 50 nt

  26. Pyroséquençage… Et la lumière fut !

  27. Origine génomique des loci producteurs de piRNA

  28. Biogenèse et mécanisme d’action des piRNA chez la drosophile

  29. Deep sequencing of Ago2-associated small RNAs

  30. Biogenèse des endo-siRNA: 3 type de loci producteurs Les éléments répétés, transposons et rétrotransposons Des ARN non-codants « structurés » Les zones de recouvrement des 3’ UTR (gènes convergents)

  31. Endo-siRNAs silence transposable element in the soma (as do piRNAs in the germ line)

  32. Transposon repression Heterochromatin formation Defense against viruses Transposon repression Heterochromatin formation Regulation of gene expression

  33. Mathieu Bartoletti Bassam Berry Corinne Besnard-Guerin Anne-Laure Bougé Caroline Jacquier Josette Pidoux Edwige Seguy Hélène Thomassin

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