Sistema NF-kB e sua modulazione a fini terapeutici nelle neoplasie solide ed ematologiche

1. Sistema NF-kB e sua modulazione a fini terapeutici nelle neoplasie solide ed ematologiche Anna Marina Liberati Lorenzo Falchi Federica Di Costanzo Giorgia Desantis Paola Cerroni Annamaria Rauco

2. Perché ? Modulazione del sistema NF-kB nella strategia terapeutica delle neoplasie

3. Alterazioni genetiche dei vari componenti del sistema Meccanismi diversi in assenza di mutazioni dirette nei geni di questa via Neoplasie solide Neoplasie ematologiche Modulazione del sistema NF-kB nella strategia terapeutica delle neoplasie Attivazione NF-kB

4. Ambiente extra e cellulareNF-KBcompartimentiintracellulari NIK: NF-kB inducing kinase MEKK1: mitogen-activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase kinase1 IRAK:interleukin-1 receptor associated kinase TRAF:tumour necrosis factor alpha receptor associated factors PKC:protein kinase C

5. Sistema NF-kB È un sistema complesso Cerchiamo di renderlo semplice

6. Sistema NF-kB • Parte centrale funzionalmente attiva • (vari dimeri) • se raggiunge il nucleo –DNA • Molecole inibitorie-regolatorie-IkB • bloccano il passaggio nel nucleo • A+B sono legate in un unico complesso Dimeri interattivi con DNA IkB Fosforilazione IkB

7. Sistema NF-kB Funzionalmente complesso ed attivato da sistemi complessi Ma cerchiamo di rendere il tutto più semplice Stimoli esterni: Molecole ad attività chinasica –IKK Fosforilazione di IkB rende possibile il legame con ubiquitina  Degradazione di IkB   B si stacca da A A migra nel nucleo a svolgere il suo lavoro, NF-kB IKK Attivazione di varie vie di trasduzione del segnale che attivano IKK

8. Sistema NF-kB È un sistema complesso Cerchiamo di renderlo semplice

9. Esame del sistema Sistema NF-kB Ogni parte del sistema è formato da proteine con funzioni diverse  +/- Dimeri interattivi con DNA

10.  trascrizione  trascrizione Sistema NF-kB + = c Rel; Rel A/p65; Rel B / - = p 50 (NFkB1) e p52 (NFkB2) • Parte centrale dimeri P50/P65 (NF-kB) P50(NF-kB1) P50/c-rel P52 (NF-kB2) P65/P65 P65/c rel

11. Funzione + Bcl-3  nucleo Sistema NF-kB B. Complesso centrale : molecole regolatorie IKB Funzione - IkB, IkB, IkB, IkB Citoplasma IkB Dimeri interattivi con DNA Bcl-3

12. C. Molecole ad attività chinasica IKK Funzione + catalitica IKK  e IKK  Funzione + di reclutamento (delle chinasi che fosforilano il sist. IKK , , ) IKK  Funzione – regolatrice IKK  (NEMO) Sistema NF-kB

13. Citochine, ROS, Tat, Tax, LPS… TAK, PKC, PKR, Cot… Akt, NIK, MAPKKK   IKK  P NF-kB IkB IkB p65 p65 p65 p50 p50 p50 SCF-β-TrCP Β-catenina, cicline, Vpu antigeni, p53 cicline PROTEOSOMA p65 p50 IkB p65 IkB IkB p50 UB UB MEMBRANA PLASMATICA CITOPLASMA molecole di adesione Bcl-xL, c-IAP citochine Cox-2, iNOS ciclina D1… UB NUCLEO

14. E2 E3 Target ATP + E1 + + Ubiquitina + +

15. Citochine, ROS, Tat, Tax, LPS… MEMBRANA PLASMATICA TAK, PKC, PKR, Cot… CITOPLASMA Akt, NIK, MAPKKK   IKK  P NF-kB IkB IkB p65 p65 p65 molecole di adesione Bcl-xL, c-IAP citochine Cox-2, iNOS ciclina D1… p50 p50 p50 SCF-β-TrCP Β-catenina, cicline, Vpu antigeni, p53 cicline PROTEOSOMA UB p65 p50 IkB p65 IkB IkB p50 UB NUCLEO UB

16. Ruolo di NF-kB nella vita cellulare SOPRAVVIVENZA CELLULARE E’ FACILITATA Trascrizione di geni Enzimi di risposta allo stress Molecole direttamente coinvolte nel ciclo cellulare Molecole di adesione Proteine anti-apoptotiche Bcl-2, cIaP1, cIaP2 Citochine pro-infiammatorie

17. NF-kB-APOPTOSI Proteine anti-apoptotiche Bcl-2, cIaP1, cIaP2

18. p53 Fas, FasL Bax, Noxa, pig3 NF-kB Bcl-x, Bcl-2 MITOCONDRIO cIAPs, XIAP Diabo/Smac CASPASI-8 CASPASI-3,7 CASPASI-9 Cit. C APOPTOSI Apaf1 VIA INTRINSECA AIF VIA ESTRINSECA VIA ESTRINSECA E INTRINSECA DELL’APOPTOSI INIBITE DA NF-KB

19. NF-kB-CICLO CELLULARE Molecole direttamente coinvolte nel ciclo cellulare

20. CICLINA D CDK4/6 NF-kB p53 GADD45 p21waf1 CICLINA B CDC2 x x P CDC25 G1 S CDC25 G2 Chk1 e 2 M G1 NF-kB e regolazione del ciclo cellulare

21. attività NF-kB nella transizione G0-G1 Ruolo di NF-kB nella regolazione del ciclo cellulare Prove indirette: Il ruolo critico di NF-kB nel controllo del ciclo cellulare è dimostrato indirettamente • livelli di NF-kB “attivato” correlano con i segnali che controllano il ciclo cellulare • inibizione di NF-kB “attivato” determina un ritardo nella transizione G1-S

22. Ruolo di NF-kB nella regolazione del ciclo cellulare Prove dirette: siti di legame di NF-kB nella regione “promoter” del gene che codifica per la ciclina D1 ciclina D1 e ciclinochinasi (CDK4 e CDK6) G1  S attraverso la fosforilazione CDK-dipendente di pRb liberazione di E2F attivazione geni S-fase specifici

23. Linfomi  NK-kB • Varie componenti (una o più) del sistema sono danneggiate • Come conseguenza di 1 si può realizzare o non attivazione costitutiva nucleare di NF-kB • Attivazione di NF-kB si può realizzare anche attraverso altre vie

24. Ruolo di c-rel nell’oncogenesi • Modelli animali  oncogenicità acuta del derivativo virale (oncoproteina v-Rel) • 2. Amplificazione del gene umano c-rel 23% DLCL •  75-85% presentazioni • extranodali DLCL •  forma primitiva del mediastino •  alcune forme di L.follicolari (LF) • 3. Riarrangiamento del gene umano c-rel  alcuni (pochi) casi di LF ed alcuni DLCL

25. vantaggio selettivo di crescita induzione linfomi in modelli animali associazione con forme clinicamente avanzate di DLCL Ruolo di c-rel nell’oncogenesi proteina ibrida “c-rel Nrg” DLCL (dominio N terminale RH di c-rel + sequenze di geni non correlati) transattivazione del dominio C-terminale

26. Ruolo di Rel-A nell’oncogenesi • Alterazioni cromosomiche coinvolgenti Rel-A (11q-13) relativamente infrequenti • Sporadiche traslocazioni cromosomiche coinvolgenti il gene Rel-A • in LNH e MM • Amplificazione di Rel-A in sporadici casi di DLCL

27. Ruolo di NF-kB1 nell’oncogenesi Rare alterazioni (strutturali e di espressione) del gene NF-kB1 (4q24) sono presenti nelle leucemie e nei linfomi

28. Traslocazioni e delezioni di nf-kb2(10p24) sono frequenti in diversi tipi di linfomi B e T cellulari • Traslocazioni o delezioni di nf-kb2 • produzione di una p100 “troncata” con parziale delezione del dominio C-terminale • Fusione in alcuni casi con sequenze eterologhe Ruolo di NF-kB2 nell’oncogenesi

29. Ruolo di NF-kB2 nell’oncogenesi • La conseguenza funzionale della traslocazione o delezione è localizzazione nucleare “constitutiva” della p100 “troncata” e suo legame ai “KB-DNA motifs”senza formazione della p52 matura

30. Ruolo di NF-kB1 nell’oncogenesi Rare alterazioni (strutturali e di espressione) del gene NF-kB1 (4q24) sono presenti nelle leucemie e nei linfomi

31. Traslocazioni e delezioni di nf-kb2(10p24) sono frequenti in diversi tipi di linfomi B e T cellulari • Traslocazioni o delezioni di nf-kb2 • produzione di una p100 “troncata” con parziale delezione del dominio C-terminale • Fusione in alcuni casi con sequenze eterologhe Ruolo di NF-kB2 nell’oncogenesi

32. Ruolo di NF-kB2 nell’oncogenesi • La conseguenza funzionale della traslocazione o delezione è localizzazione nucleare “constitutiva” della p100 “troncata” e suo legame ai “KB-DNA motifs”senza formazione della p52 matura

33. p100 “troncata” attiva “da sola”la trascrizione genica p100 “troncata”  agisce come transattivatore costitutivo Ruolo di NF-kB2 nell’oncogenesi Modello proposto: p100 tumorali alterazione della trascrizione NF-kB mediata

34. Ruolo di Bcl-3 nell’oncogenesi •Proteina Bcl-3 strutturalmente correlata alla famiglia dei regolatori IkB di Rel/NF-KB ••Bcl-3 è presente nel nucleo ove interagisce con omodimeri di p50 e p52 alterandone la loro attività DNA legante e modulando l’espressione genica •••Bcl-3 favorisce la trascrizione NF-kB mediata rimuovendo dal DNA omodimeri p50 inattivi •••• Bcl-3 agisce come co-attivatore per omodimeri p52

35. Ruolo di Bcl-3 nell’oncogenesi •Il gene bcl-3(19q 13.1) è coinvolto in una rara, ma ricorrente traslocazione t(14;19) (q32.3;q13.2) riscontrata nella LLC-B ••Le traslocazioni che coinvolgono bcl-3 determinano una iper-espressione della normale proteina Bcl-3 •••Iper-espressione di Bcl-3  “step” critico nel modello multisteps che determina la trasformazione cellulare

36. Ruolo della inattivazione di IkB nell’oncogenesi •IkB  inibitore di NF-kB ••Iper-espressione antisenso di trascritti Ikb  trasformazione di cellule murine NIH₃ •••Ridotta attività di IkB correla persistente localizzazione nucleare di NF-kB e suo legame con il DNA ed attività transattivante

37. Ruolo della inattivazione di IkB nell’oncogenesi Linfoma di Hodgkin IkB = “tumor-suppressor” Gene ikb : localizzato sul cromosoma 14q13 Nel LH sono presenti mutazioni inattivanti in ikb e/o ikb con deregolazione funzionale del complesso NF-kB/IkB e conseguente attivazione di NF-KB. Nel LH esiste una correlazione inversa tra i livelli delle proteine IkB e IkB e l’attivazione di chinasi IkB (IKK) Sebbene la regione cromosomica 14q13 non sia frequentemente coinvolta in riarrangiamenti o delezioni cromosomiche nel LH, non si può escludere che mutazioni non identificate siano presenti in molti casi di questa malattia.

38. Alterazioni genetiche dei vari componenti del sistema Meccanismi diversi in assenza di mutazioni dirette nei geni di questa via Neoplasie ematologiche Modulazione del sistema NF-kB nella strategia terapeutica delle neoplasie Attivazione NF-kB

39. c. RS in topi SCID Attività costitutiva nucleare di NF-kB Linfoma di Hodgkin: L’attivazione persistente di NF-kB è critica per Proliferazione Resistenza ad apoptosi Formazione di tumori Rilevanza patogenetica di NF-kB nel LH

40. Attività costitutiva nucleare di NF-kB Linfoma di Hodgkin: • Attivazione NF-kB: • diretta conseguenza di mutazioni dei geni IkB  (IkB) proteine IkB non funzionali per mancanza di varie porzioni del dominio centrale anKyrin e delle regioni C- terminali

41. Proteolisi di IkB Attività costitutiva nucleare di NF-kB Linfoma di Hodgkin: • Attivazione persistente della via di trasduzione del segnale Attivazione autocrina citochina-mediata da parte delle cellule di RS • Altri meccanismi anche correlati alla infezione da EBV

42. Mutazioni di IkBε Mutazioni di IkBα LMP1 Permanente attivaz. delle IKK (resistenza alle fosfatasi) Overespress.CD30 ed altri TNFR • reclutamento background cellulare; • localizzazione zona interfollicolare; • deregolazione proliferazione. • ↑ proteine coinvolte in: Meccanismi che determinano la costitutiva attività di NF-kB NF-kB • ↑ “network” genico di tipo antiapoptotico: ciclina D2, CD40, CD86.

43. Attività costitutiva nucleare di NF-kB Linfoma mantellare: • Interazione tra CD 154 ectopica e CD40 ancorato Attivazione NF-kB •  Cicline D1 per traslocazione t(11;14) • gene target di NF-kB

44. Attività costitutiva nucleare di NF-kB Linfomi MALT e B-CLL: Del 10 t (1;14)  attivazione NF-kB Citochine  attivazione NF-kB

45. Attività costitutiva nucleare di NF-kB ATL: • Meccanismo TAX-dipendente Proteina TAX del HTLV-1  Attivazione IKK chinasi  Attivazione NF-kB • Meccanismo TAX-indipendente • Degradazione di IkB

46. Attività costitutiva nucleare di NF-kB DLCL: Attivazione costitutiva di IKK chinasi Localizzazione nucleare NF-kB

47. Modulazione dell’attività di NF-kB • Agenti che regolano l’espressione delle proteine NF-KB ed il loro legame al DNA: • molecole antisenso • composti “NF-kB-decay” • nibitori RNA • Agenti che interferiscono con la formazione del complesso IKK: “NEMO binding-domain peptide” • Agenti che bloccano il complesso di attivazione IKKB: “Toll-IL-1 receptor adapter protein peptide” • Inibitori “heat-shock protein 90” • Inibitori del proteosoma • Inibitori dell’attività trascrizionale inclusi i glucocorticoidi

48. Omeostasi proteica e proteosoma •Omeostasi proteica è critica nei processi biologici fondamentali per la sopravvivenza cellulare ••Particolarmente rilevante è la modulazione dell’omeostasi di quelle proteine critiche nella regolazione del ciclo cellulare •••La via ubiquitina-proteosoma (UPP) è il principale meccanismo di degradazione delle proteine,comprese quelle coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare. ••••Proteosoma è un bersaglio pertanto rilevante nella terapia biologica “mirata” delle neoplasie.

49. PROTEOSOMA SUBSTRATI DIVISIONE CELLULARE Topoisomerasi IIsvolgimento DNA Topoisomerasi Isvolgimento DNA FATTORI PRO- E ANTI-APOPTOTICI ONCOSOPPRESSORI XIAPanti-apoptotico Bax pro-apoptotico Bcl2anti-apoptotico Survivinaanti-apoptotico Securinapromozione anafase P53fattore di trascrizione RBinibitore di E2F REGOLATORI TRASCRIZIONALI PROGRESSIONE CICLO Ciclina Eattivatore chinasi p27 KIP1inibitore CDK p27 CIP1/WAF1inibitore CDK Rec androgenirec nucleari; fattore di trascrizione Fos/Junfattori di trascrizione Idinibitore fattore di trascrizione ikB-αinibitore di NF-kB

50. 19S a b 19S A schematic of the 26S proteasome 20S Proteasome 26S Proteasome