INTRODUCCIÓN HA (ácido hialurónico)

1. “Oligosacáridos de ácido hialurónico inducen el clivado de CD44 y promueven la migración celular en células tumorales que expresan CD44”

2. INTRODUCCIÓN • HA (ácido hialurónico) • El ácido hialurónico(HA )es un glicosaminoglicano (GAG) lineal no sulfatado que consiste en la repetición de unidades disacarídicas formadas por D-ácido glucurónico y N-acetil glucosamina. • En condiciones normales HA usualmente se encuentra como un componente de • la matriz extracelular de alto peso molecular • Hay evidencias de que HA no solo actúa como un componente de la matriz extracelular sino que participa en numerosos eventos fisiológicos tales como la adhesión, migración y proliferación celular. • Se halló que en condiciones celulares patológicas, tales como inflamación y tumores, • HA se encuentra en una forma de bajo peso molecular. A demás se ha reportado una síntesis • aumentada de HA en varios tumores malignos • Se encontraron altos niveles de actividad hialuronidasa en tumores de próstata y vejiga sugiriendo una degradación autorregulatoria de HA en tejidos tumorales que provocaría la invasión tumoral y la metástasis.

3. INTRODUCCIÓN • Receptor de superficie celular CD44 • CD44 es una molécula de adhesión que sirve como receptor de superficie celular de varios componentes de la matriz extracelular que incluye el ácido hialurónico. • Se encuentra ampliamente distribuída y participa en varios procesos biológicos tales como: • 1)Migración de células tumorales e invasión • 2)Lynphocyte rolling • El dominio extracelular de CD44 es clivado proteolíticamente, se sugiere que este clivaje tendría un rol importante en la migración de células tumorales. • Se ha reportado un mayor nivel de clivaje del receptor CD44 en tumores invasivos tales como gliomas, carcinomas en colon y en ovarios, entre otros. • El clivaje proteolítico de CD44 puede ser inducido por ciertos estímulos como el phorbol éster y anticuerpos anti-CD44 in vitro, sin embargose desconocía el inductor fisiológico de CD44 in vivo

4. Entónces.. En células tumorales se encontró: - Por un lado, una proteólisis aumentada del receptor CD44 - y por otro lado, formas de ácido hialurónico (HA) de bajo peso molecular (oligosacáridos) El OBJETIVO Fué demostrar que pequeños oligosacáridos HA, y no polímeros largos, inducen eficientemente el clivaje de CD 44 y también promueven la migración de la célula tumoral en una forma dependiente de CD44.

5. FIG. 1. Las células MIA PaCa-2 (línea celular de carcinoma pancreático humano) expresan una forma activa de CD44 y muestran un clivaje de CD44 incrementado bajo tratamiento con phorbol ester (PMA). 1) Incuban las células con y sin fluoresceína isotiocianato conjugada al anticuerpo BRIC235 (éste se une al dominio extracelular de CD44) 2) Incuban las células con y sin fluoresceína isotiocianato conjugada a HA (FL-HA) 3) Incuban las células con y sin fluoresceína isotiocianato conjugada a HA (FL-HA) y a demás con el anticuerpo anti-CD44 o un control isotipo IgG de ratón

6. Continuación FIG. 1. Clivaje de CD44 con PMA Las células tumorales se incubaron ON 37 °C con MG132 para inhibir el clivaje secundario del domino intracelular de CD44 Las celulas fueron incubadas con y sin PMA por 30 min a 37 °C Las celulas fueron lisadas con solucion SDS. Se realizó un inmunoblotting con anti CD44 cyto pAb y con anti beta tubulina mAb Para detectar las bandas usan el sistema de peroxidasa. Se midió la fracción soluble al incubar células tumorales con o sin PMA mediante ELISA

7. FIG. 2. El clivado de CD44 es incrementado por fragmentos HA pero no por HA de 200-KdA Ha de 200 K-da fue digerido con hialuronidasa y los productos fueron analizados por HPLC Inmunoblotting para detectar el producto de clivaje de CD44 al incubar con una frHA Corroboran que se produce clivaje por frHA y no por HA de alto PM

8. A,B: Digestión de la mezcla frHA con hialuronidasa SD intacta o inactivada. C:Inmunoblotting para un ensayo de clivaje de CD44 FIG. 3. La digestión de los fragmentos de HA hasta disacáridos anula su efecto inductor sobre el clivaje de CD44 “El efecto inductor se debía a frHA y no a moléculas contaminantes presentes en la mezcla”

9. Inmunoblotting para un ensayo de clivaje de CD44 Análisis densitométrico de la banda de 25 KDa “Sólo fragmentos de cierto tamaño pueden incrementar el clivaje de CD44” FIG. 4. El clivaje de CD44 es inducido por oligosacáridos pequeños de tamaño uniforme pero no por largos polímeros.

10. ¿Los fragmentos HA regularán el clivaje de CD44 a través de la unión al receptor? 1.con o sin FL-HA 2.anti- CD44 y FL-HA Pretratamientos (HA de distintos tamaños sin marcar) Pico punteado: sin pretratamiento y sin FL-HA Pico sin sombrear: Sin pretratamiento y con FL-HA Pico sombreado: Con pretratamiento y con FL-HA FIG. 5. Los fragmentos HA de 6.9-kDa (de efecto inductor) se unen al receptor CD44 de superficie celular.

11. Inmunoblotting para un ensayo de clivaje de CD44 FIG. 6. El clivado de CD44 inducido por fragmentos HA es bloqueado por un anticuerpo anti-CD44 mAb BRIC235 (frag. Fab). El clivaje inducido por HA se debe a la interacción entre los fragmentos HA y el receptor CD44

12. Anti-CD44cyto pAb Microscopía de inmunofluorescencia Rhodamine-conjugated phalloidin FL-goat anti- rabbit IgG FIG. 7. HA de 6.9-kDa induce la formación de filopodios.

13. “HA de bajo PM no sólo induce el clivado de CD44 sino también la migración celular dependiente de CD44” Boyden-type chamber assay FIG. 8. HA de 6.9-kDa induce una migración celular y ésta es inhibida por un anticuerpo bloqueante anti-CD44 .

14. Fragmentos de HA inducen el clivaje del receptor CD44 en células de carcinoma pancreático humano • La digestión a disacáridos de los fragmentos de HA anula su efecto inductor sobre el clivaje de CD44 • Sólo fragmentos de HA de cierto tamaño pueden inducir el clivaje de CD44 (particularmente aquéllos que poseen entre 6 y 36 monómeros). Estos oligosacáridos constituyen probablemente el inductor fisiológico del clivaje de CD44. • El clivaje inducido por HA se debe a la interacción entre los fragmentos HA y el receptor CD44 • Los fragmentos de HA de 6.9 KDa (de 36 monómeros principalmente) promueven la migración de células de carcinoma de una manera que depende de CD44 • “El tamaño de la molécula de ácido hialurónico sería clave en su función, atribuyéndole particulares actividades biológicas” Conclusiones

15. Discusión

16. Otros científicos reportaron que las células MIA Paca-2 se despojan de CD44 espontáneamente por 2 mecanismos diferentes, uno mediado por metaloproteasas unidas a membrana y otro mediado por una serina proteasa. A juzgar por el tamaño del producto de clivado (aprox. 25 KDa), MT1-MMP estaría probablemente involucrada en parte en el clivaje de CD44. El clivaje de CD44 inducido por pequeños oligosacáridos HA puede tener una importante relevancia en la biología tumoral. Los oligosacáridos pequeños de HA pueden promover la invasión tumoral no sólo por inducción de angiogénesis sino también por servir como una molécula señal a CD44, incrementando el despegue de la célula tumoral del tejido primario e induciendo el pegado de la células tumorales a las células endoteliales e incrementando la motilidad celular.