Testování toxicity průmyslových chemikálií II – senzibilizace kůže a genotoxicita

1. Testování toxicity průmyslových chemikálií II – senzibilizace kůže a genotoxicita Průmyslová toxikologie (C867)

2. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) Testovací metody • LLNA – Local Lymph Node Assay (Test regionálních mízních uzlin) - OECD 429 • GMPT - Maximalizační test na morčatech - OECD 406

3. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429 • Vyvolání alergické reakce vyžaduje aktivaci a následnou expanzi T-lymfocytů • Střet kůže se senzibilizátorem vyvolá transport antigenů z kůže do lymfatických uzlin • Antigenem řízená aktivace T-lymfocytů má za následek dělení a diferenciaci alergen-specifických T-lymfocytů • Nárůst počtu T-lymfocytů je měřitelným ukazatelem reakce organismu na kontakt s látkou mající senzibilizační potenciále

4. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429 • Pokusná zvířata – samice myší staré 8 – 12 týdnů, kmen BALB/c, NMRI Postup • testovaná látka – 3 různé koncentrace • negativní kontrola – aceton/olivový olej, dimethysulfoxid aj. • pozitivní kontrola - dinitrochlorbenzen aj.

5. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429 DEN 1 – 3 • aplikace test. látky na dorsální stranu obou uší , aplikační objem 25 mLna ucho DEN 6 • aplikace fyziologického roztoku obsahujícího předepsané množství radionuklidu • (3H thymidinnebo 125I deoxyuridin) • 5 hodin po aplikaci utracení zvířat a odběr uzlin

6. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429

7. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429

8. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429 Vyhodnocení • Příprava buněčné suspenze • Měření inkorporované aktivity v dpm Výpočet Indexu stimulace: • průměrná hodnota dpm exponované skupiny/ průměrná hodnota dpm kontrolní skupiny • je-li IS větší nebo roven 3 je látka považována za senzibilizující. • dávková závislost

9. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) GMPT - OECD 406 • Indukční fáze: • kontaktem kůže se senzibilizátorem jsou aktivovány T-lymfocyty a dochází k jejich proliferaci (jako u testu LLNA) • Provokační fáze: • opakovaným kontaktem se senzibilizátorem je u zvířete vyvolána alergická reakce – kontaktní dermatitida Pokusná zvířata: • albinotická morčata obou pohlaví, váha 150 – 250 g, kmen BFC, ve studii 30 zvířat (20 exponovaných + 10 kontrolních)

10. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) Metodika: • DEN 1 - indukční expozice intradermální • DEN 7- lokální indukce dermální • DEN 21- provokace • DEN 23 a 24 – odečet kožní reakce GMPT - OECD 406 • Vyhodnocení: • 24 a 48 hodin po aplikaci se vyhodnotí kožní reakce (zarudnutí, otok) • Porovnává se reakce kůže exponované testovanou látkou a reakce kůže exponované vehikulem • Pozitivní výsledek = 30% morčat má pozitivní reakci na kůži tj. zarudnutí případně otok

11. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) Porovnání GPMT a LLNA testu GMPT : • Manipulace: holení, injekční aplikace, opakovaná bandáž • Test trvá 25 dní • Výsledek = subjektivní hodnocení LLNA: • Manipulace: přímá aplikace test. látky neinvazivní formou • Test trvá 6 dnů • Výsledek = číslo • U některých látek nelze použít

12. Genotoxicita • Studie poskytují informace o možných genotoxických vlastnostech látek tj. o schopnosti způsobovat změny genetického materiálu - mutace Rozdělení mutací • genové - změny v molekule DNA • chromozomální - chromozomální aberace (změny struktury a tvaru chromozómu) • genomové - změny v chromozomálním počtu • nechromozomální - mimojaderné

13. Genotoxicita - testovací metody • Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro • Mutagenita - test chromozómových aberací v kostní dřeni savců in vivo • Mutagenita in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech • Mutagenita-test reverzních mutací u baktérií • Genové mutace-Saccharomyces cerevisiae • Mitotické rekombinace Saccharomyces cerevisiae • Mutagenita-test genových mutací v savčích buňkách in vitro • Poškození DNA reparace- neplánovaná syntéza DNA-savčí buňky in vitro • SCE - výměna sesterských chromatid in vitro • Recesivní letální mutace vázané na pohlaví u Drosophilla melanogaster • Test transformace savčích buněk in vitro • Dominantní letální test u hlodavců

14. Mutagenita - test reverzních mutací u baktérií – OECD 471 • Detekce genových mutací – mutace v genu pro syntézu aminokyselin His (Trp) • zkouška pro počáteční vyšetření genotoxické aktivity • pět kmenů bakterií je vystaveno působení zkoušené látky za přítomnosti i bez přítomnosti metabolického aktivačního systému • aktivační systém – posmitochondrionální frakce z jater hlodavců ošetřených prostředkem indukujícím enzymy • Kontrola počtu narostlých kolonií po 48-72 hod – porovnání počtu kolonií revertantů (v přítomnosti testované látky) s počtem kolonií spontánních revertantů (NK)

15. Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473 • Identifikace látek způsobující strukturní chromozomové aberace = změny ve struktuře nebo počtu chromozomů • zjištění možných mutagenů a karcinogenů u savců Základní rozdělení aberací: • Chromatidového typu • Chromozomového typu • Pro test se používají stabilizované buněčné linie, buněčné kmeny nebo primární buněčné kultury

16. Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473 • Kultury jsou vystaveny zkoušené látce (a to s metabolickou aktivací i bez ní), v předem stanovených intervalech se přidává látka zastavující metafázi (např. Kolchicin) • Hodnocení přítomnosti chromozomových aberací - nejméně 200 mitóz (46±2 centromery) • Stanoven Mitotický index - buňky v metafázi : celkový počet buněk v populaci • Procento aberentních buněk vůči negativní kontrole

17. Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473 Chromozomový zlom Chromozomové aberace - příklady Prstencový chromozom (kruhový fragment)

18. Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473 Acentrický fragment Chromozomové aberace - příklady Dicentrický chromozom

19. Mutagenita – in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech - OECD 474 • Mikronukleus test zjišťuje poškození, jež testovaná látka způsobuje v chromozómech nebo mitotickém aparátu erytroblastů. • Výsledkem cytogenetického poškození je vznik mikrojader – chromozómových fragmentů v erytrocytech a současně změna v poměru zralých a nezralých erytrocytů v kostní dřeni. • Pro tento test existuje in vitro metoda – v současné době je ve fázi schvalování • Metodika in vivo – pokusné zvíře potkan • testovaná látka v 1 – 3 koncentracích • negativní kontrola + pozitivní kontrola • jednorázová aplikace • vyšetření kostní dřeně 24 a 48 hodin po aplikaci

20. Mutagenita – in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech - OECD 474 Hodnocení kostní dřeně Normochromní erytrocyt: • zralý erytrocyt, barvící se eosinofilně – červenooranžově Polychromní erytrocyt: • nezralý erytrocyt, barvící se bazofilně - šedomodře Mikrojádra: • fragmenty jádra vznikající během dělení buňky z chromozómů opožděných v dělení Hodnocení • poměr zralých a nezralých erytrocytů • přítomnost nezralých erytrocytů s mikrojádry

21. Mutagenita – in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech - OECD 474 savčí buňky s mikrojádry – in vitro test - příklady

22. Mutagenita – kometový test (Comet assay)